안녕하세요. pET28b(+) vector에 CBD insert를 cloning하는 실험을 진행 중인 예비 석사생입니다.
현재 colony PCR에서 target band가 확인되지 않고, 반복적으로 300–400 bp 정도의 band만 보여 어느 단계에서 문제가 생긴 것인지 조언을 구하고 싶습니다.

실험 흐름은 대략 다음과 같습니다.

1. CBD,GFP fragment PCR
2. OE PCR로 GFP/linker/CBD 형태의 insert 제작
3. OE PCR product를 gel extraction
4. 제한효소 처리 후 cleanup
5. ligation
6. DH5α 또는 BL21 transformation
7. colony PCR로 확인

현재 사용 중인 vector는 pET28b(+)이고, insert는 CBD가 포함된 fragment입니다. CBD domain이 2개 있는 형태라서, 이 반복 서열 때문에 PCR이나 colony PCR에서 non-specific amplification이 생길 수 있는지도 궁금합니다.

문제 상황은 다음과 같습니다.

* Colony는 형성됨
* Colony PCR에서 예상 target band는 나오지 않음
* 대신 300–400 bp 사이의 band가 반복적으로 관찰됨
* OE PCR product를 gel extraction하여 사용하고 있음
* Cleanup은 Promega cleanup kit 사용
* Digestion cleanup 후 NanoDrop 순도가 좋지 않음
    * 예: 15.3 ng/µL, A260/280 = 3.4, A260/230 = 0.210
* 처음부터 순도가 아주 좋지는 않았고, OE PCR product gel extraction 및 cleanup 단계를 거치면서 점점 더 나빠지는 느낌이 있음

제가 궁금한 부분은 다음과 같습니다.

1. Colony PCR에서 target band는 안 뜨고 300–400 bp 정도의 band만 반복적으로 뜨는 경우, 가장 먼저 의심해야 할 원인이 무엇일까요?
    예를 들어 insert가 안 들어간 colony, primer non-specific binding, primer 위치 문제, partial insert, vector self-ligation 중 어떤 가능성이 큰지 궁금합니다.
2. CBD domain이 2개 있는 반복 구조가 colony PCR에서 300–400 bp 정도의 비특이적 band를 만들 가능성이 있을까요?
    CBD 내부 반복 서열이나 유사 서열 때문에 primer가 의도하지 않은 위치에 붙을 수 있는지 궁금합니다.
3. OE PCR product를 gel extraction하는 과정에서 DNA 손실이나 salt/guanidine/ethanol contamination이 생기면, 이후 digestion/ligation 효율이 크게 떨어질 수 있나요?
    NanoDrop상 A260/230이 매우 낮은데, 이 상태의 DNA를 계속 사용하면 cloning 실패로 이어질 가능성이 큰지 궁금합니다.
4. 현재처럼 cleanup을 거칠수록 순도가 더 나빠지는 경우, gel extraction 과정 자체를 의심해야 할까요?
5. 이런 상황에서는 다음 단계로 무엇을 먼저 확인하는 것이 좋을까요?
    예를 들어 colony PCR primer 재설계, insert/vector digestion gel 확인, ligation 조건 변경, miniprep 후 restriction digestion 확인, OE PCR product 재정제 중 어떤 순서로 해결하는 것이 좋을지 조언 부탁드립니다.

+ 참고로 target band 예상 크기: 1.3 kb ~1.4 kb/ 제한효소로는 NdeI, XhoI/ colony pcr 할때는 T7 promoter, T7 terminator 사용합니다

비슷한 경험이 있으신 분들의 조언 부탁드립니다. 감사합니다.