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실험 Q&A
Q miniprep 농도 낮게나옴
레벨05 성주신 (대학원생)
- 26.07.08 12:04 (수정)
- 조회289
안녕하세요. Miniprep 후 pDNA 농도가 갑자기 낮게 나옵니다.
기존 농도 : 1500~2000ng/ul (아래사진첨부)
현재농도 : 200~300ng/ul (아래 사진첨부)
Gel 내린걸로 봤을땐 별 차이가 없어 보이긴 합니다.
1) miniprep kit 변경
2) com.cell 변경
3) kanamycin 변경
4) Nanodrop , shaking incubator , miniprep kit 등 다른방 것 사용
5) 여러 종류의 plasmid 사용
6) LB agar plate, LB broth 다시 만듬
할 수 있는건 다 해봤음에도 불구하고 농도가 계속 낮게 나옵니다.
제 실험과정은 아래와 같습니다.
Transformation -> 5ml culture -> miniprep -> 20ul elute (고농도 pDNA가 필요)
콜로니도 잘떴고 LB도 뿌얬고 펠렛상태도 좋았는데 미니프렙만 하면 농도가 낮게나오네요.
같은 경험이 있으신분 도와주시면 감사하겠습니다.
Mol. Biol.-DNA > Purification/Isolation
- 26.07.09 09:18
이전 문제는 해결하셨다 하니 정말 다행입니다ㅠ
혹시 이 실험 결과도 질문자님이 하신건지 궁금합니다.
결과 양상의 차이가 있는게 실험자의 차이인지 궁금해서요.
네 vector이름을 알려주시면 됩니다.
- 26.07.10 17:52 (수정)
- 질문자
위의 vector로 cloning 진행했습니다.
네 둘다 저의 실험결과 입니다.
아래는 1300ng/ul의 plasmid DNA와 165ng/ul의 pDNA gel을 내린 것인데 크기 차이가 확연하네요.
vector 문제인가해서 각각 다른 plasmid 3~4종류 정도 실험해보았는데 농도가 다 낮게 나옵니다.
-
채택된 답변입니다.
- 26.07.13 11:27
훔,,,일단 지금 뽑혀진 양을 보면 너무 낮은건 아니에요.
그리고 용출되는 양이 적어서 20ul 로 elution하신 걸텐데..
너무 적은 볼륨으로 elution하면 오히려 충분히 용출이 안될 수 있어요! 그래서 프로토콜에서 제시하는 mini 볼륨은 가급적이면 지켜주셔야 해요.
(컬럼의 멤브레인이 다 안적셔져서..ㅠ)
대신 용출한 농도가 너무 적을 경우 elution 볼륨을 줄이는게 아니라, elution은 프로토콜에서 제시하는 미니멈 볼륨 그대로 하고.
elution된 샘플의 액체를 고온의 환경에서 다 날려버린 다음(heat block 같은곳에서 뚜껑열어서 다 날림)
적은양(20ul 정도)의 DDW를 넣어서 농도를 높일 수는 있습니다.
그리고 지금 사이즈 차이가 나보인다고 했는데 혹시 찜찜하다면 enzyme cut하고 전기영동해서 사이즈를 확인해보는게 좋아요.
(인서트 앞 뒤로 있는 Enzyme가지고)
내가 원하는 인서트가 들어간 콜로닝 벡터가 맞다는 검증인거죠. 혹시 다른 샘플일 수도 있으니..
실험자도 같고 샘플도 같고 실험 방법도 같은데 양에 왜 이렇게 차이가 있는지는 사실 저도 잘 모르겠습니다.
글로써 남겨지지 못한 예상치 못한 변수가 있을 수도..ㅠ
일단 지금으로써는 너무 낮은 볼륨으로 elution해서 충분히 DNA가 용출되지 않은거 아닐까? 하는 의심이듭니다.
이 부분에 대한 재 실험 및 확인이 필요할 것 같네요.
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