안녕하세요, 전문가 선생님들께 조언을 얻고자 글을 올리게 되었습니다. HPDE6c7 (Human Pancreatic Ductal Epithelial Cell Line, Merck Cat. #SCC442) 세포주를 배양 중인 초보 연구원입니다.
이번에 Thaw를 진행하여 Passage +1 상태로 배양 중인데, Thaw 이후 Day 9인 지금까지 세포가 넓게 펴지며 완전히 정착하지 못하고 동글동글하게 둥둥 떠다니는 현상이 일어나고 있습니다.
Thaw 시점의 Viability는 84.3%였고 , 삼투압 쇼크(Osmotic shock)를 방지하기 위해 배지를 2~3초에 한 번씩 dropwise로 아주 천천히 떨어뜨리며 완충하는 정석 프로토콜을 철저히 지켰습니다.
현재 배지는 데이터시트 가이드라인을 참고하여 Keratinocyte Serum-Free Growth Medium에 BPE와 EGF를 희석하여 제조해 사용 중입니다. 중간에 안 붙어서 EGF 농도를 2배로 24시간동안 올려보았으나 아무런 진전이 없었습니다.
과거 데이터시트와 최신 개정판 데이터시트를 대조해 보니, 이 세포주의 무혈청 메인 Basal 배지 카탈로그 품번이 Sigma에서 PromoCell, 최근에는 Cell Biologics 제품으로 계속 바뀌어온 것을 확인했습니다. 혹시 저와 동일하게 HPDE6c7을 키우시면서 세포가 아예 안붙는 문제를 겪으신 분이 계시는지요? 어떻게 해결 하셨을까요? EGF를 희석할 때 파우더를 0.1% BSA 포함된 PBS에 녹여서 믹스했는데, 이 과정에서의 PBS 양 때문에 문제가 생겼을까요?
당장 세포가 붙지않고 떠다녀 전멸할 위기라, 일단 무혈청 환경을 포기하고 [일반 DMEM + 10% FBS + Y-27632 (10 uM) + 액상 Fibronectin (2 ug/mL)] 조합으로 배지를 전면 리셋한 뒤, Collagen이나 Matrigel 코팅된 T25 플라스크에 강제로 원심분리(Centrifugal seeding, 100g)하여 바닥에 내리꽂는 응급 조치를 시도하려고 합니다.
혹시 이 세포주를 먼저 키워보신 선배 연구자분들 중에서, 저처럼 안 붙고 겉돌던 HPDE6c7 세포를 극적으로 살려내신 경험이나, 배지 조성 상에서 제가 놓치고 있는 치명적인 디테일이 있다면 부디 아낌없는 조언과 한 수 가르침을 부탁드립니다.
실험 일정이 완전히 꼬여 피가 마르는 심정입니다. 작은 단서라도 좋으니 댓글 남겨주시면 정말 감사하겠습니다.
