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Q HeLa cell plating 후 세포가 한쪽으로 몰리는 현상 이유를 모르겠습니다

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레벨01 NEJ (대학원생)

  • 26.07.01 19:15
  • 조회448
안녕하세요
저는 세포 실험을 하고 있는 석사과정입니다!

지금까지는 항상 suspension cell 만 다뤄오다가 이번에 adherent cell 중 하나인 HeLa에 대해 실험을 진행하였는데요,
W.B sampling을 위해 세포를 12 well plate에 plating 해줬습니다.
이후 약물을 투여할 예정이라 세포가 전체적으로 골고루 퍼져야하는데
사진과 같이 무언가 막힌 모습, 선 밖을 나가지 못하고 한쪽에 모여있는 모습이 모든 well에서 관찰되었습니다. 
몇번째 실험해도 같은 현상이 나타납니다.

처음에는 cell + media가 well에 한번에 깔리지 못해 그 잠시 간 이렇게 되었나 싶어 
이번에 media 1ml을 12well plate에 먼저 분주한 후 well 바닥 전체 면을 덮을 수 있도록 살짝 흔들어주고,
이후 cell을 개수에 맞춰 모든 well 에 넣어줬습니다만
이전과 같은 현상이 나타났습니다.

혹시 이러한 문제에 대한 원인이나 해결 방법을 알고 계신 선배님들께 여쭤보고 싶습니다.
빨리 다음 스텝으로 넘어가야하는데 찾아봐도 제가 부족한 것인지 이런 경우는 잘 없는 것 같습니다.
HeLa cell plating 후 세포가 한쪽으로 몰리는 현상 이유를 모르겠습니다

Cell Biology > Cell Culture

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답변등록

A 답변 7

  • 레벨05 biotech25 (과기인)
  • 26.07.01 20:09
혹시 인큐베이터 수평은 확인해 봤나요?  실험실에 level tool이 없다면  Bubble level app을 폰에 다운 받아서 해 보세요. 그런데, plate 가운데에 라인이 생긴걸로 봐서는  인큐베이터에 놓으면서 한쪽으로 쏠린거 아닌가 보이는데,  cell 을 분주하고 아예 흔들지 말고 incubator 에 넣어보거나, 아니면 옆 실험실의 incubator에 넣어보세요.  


  • 레벨01 NEJ (대학원생)
  • 26.07.02 14:23 (수정)
  • 질문자
답변 감사드립니다!
수평은 쟤보니까 수평 0도 그대로 맞습니다!! 다음번엔 흔들지 않고 조심해서 넣어보겠습니다!
원래는 잘 퍼지라고 앞 뒤 양 옆 한번씩 흔들어줬었습니다!
  • 레벨05 SoliDeo (대학원생)
  • 26.07.02 00:23
adherent cell 중 하나인 HeLa cell은 부착성이 강한 세포 중 하나입니다.
또한 12well과 같이 비교적 지름 사이즈가 작은 well에 seeding할 경우, 흔들어도 크게 이동하지 않을 수 있습니다. 처음 seeding할때가 중요합니다. 
제안 드리는 해결법은 12 well에 seeding할 media와 seeding할 세포 수를 counting하여 합치고 media와 세포들이 고르게 섞이도록 피펫 에이드로 혼합 한 후, well에 1 mL로 seeding하는 것을 추천합니다. 
가령 12 well plate에 들어가는 media volume이 12 mL 이지만 lose 되는 것 까지 생각하여 13 mL 이상으로 준비하고 그에 맞는 세포를 계산하여 준비를 합니다. 
총 media 13 mL + 13 mL에 해당하는 세포를 준비하여 혼합합니다. 이를 각 well에 1 mL씩 seeding하면 별도로 흔들지 않아도 고르게 seeding 될 겁니다. 
참고하세요. 실험 화이팅!!
  • 레벨01 NEJ (대학원생)
  • 26.07.02 14:23
  • 질문자
답변 감사드립니다!
이번이 3번째 plating인데 처음으로 media 분주 후에 세포를 seeding 하는 방식을 사용해보았습니다!
이전 1,2번째에는 말씀해주신 방법으로 원래 plating하고 있었습니다.
1,2번째에 필요한 농도자체로 만들어 12well plate에 1ml 씩 plating 하였을 때 저렇게 나왔습니다.
처음에 저는 원인이 media+cell 1ml 분주 시에 well 바닥을 한번에 다 덮지 않아
plate를 흔들어서 바닥을 다 덮기 전의 media가 닿지 않은 부분의 차이가 저러한 장벽 모양을 나타낸다고 생각하였습니다.
그렇기에 media로 well을 코팅?해준 다음 cell을 넣으면 괜찮아 질 수 있다 생각하여 이렇게 3번째 실험을 해보았는데 똑같이 나왔습니다..
plate를 incubator에 넣기 전에 보았을 때 중간에 약간 희뿌옇게 세포들이 모인 것 처럼 보이긴 하더라구요
그렇지만 아무리 모여있다하더라도 density가 다른 것이 아니라 저렇게 장벽이 쳐진 것 처럼 세포가 자란 것이 이상해보이더라구요
이걸 파이펫팅으로 풀어주면 조금더 좋을 수도 있을까라는 생각이 들기도 했는데,,,
혹시 어떻게 해보는게 좋을까요,,?
  • 레벨05 SoliDeo (대학원생)
  • 26.07.04 00:32
파이펫팅으로 어느 정도 풀어주는 것은 괜찮을 것 같습니다. 하지만 이러한 과정이 세포에는 미미하겠지만 스트레스로 될 수 있다는 점 염두하시길 바랍니다.
  • 레벨05 오치 (과기인)
  • 26.07.02 17:14
답변까지 참고했을 때, 실험적으로 큰 문제는 없다고 보여집니다.

비교적 짧은시간에 방치한 것으로, 사진과 같이 드라마틱하게 나뉘어서 세포가 부착되기도 힘들 것 같고요.

결과를 보고 고려해볼 때, 아래 정도를 고려하고 실험을 진행해보면 좋을 것 같습니다.


1. 인큐베이터 수평 재확인: 수평계가 아닌, 실제 Plate에 적정량에 Media (DW, PBS, Culture Medium 종류 상관 없음)를 채운 뒤에 육안으로 Media가 한쪽으로 치우치진 않는지 확인

2. Plate 종류 확인: 단순하지만, 가끔 실수할 때가 있습니다. Cell culture 전용 plate가 맞는지 확인
                              추가로, Plate 배치를 바꿔보는 것도 좋을 것 같습니다. 간혹 실험실에서는 클린벤치나 BSC안에 plate를 방치하고 사용하는 경우가 많아, 
                             UV 장기간 노출로 plate coating 표면에 영향을 주진 않았는지를 확인하기 위함입니다.
                            
3. 주변 동료 도움 요청: 이전에 부착 세포를 잘 배양하신 분이 있다면, 작은 뇌물을 주면서 seeding 부탁하거나 같이 동시에 진행하면서 결과 비교하기
                                   추가로, 인근 lab에 도움 요청할 분이 있다면, 해당 lab에 방문해서 같이 실험하면 더 좋을 것 같습니다.


위 고려사항 참고해서 재실험을 해본다고 하면, 어느정도 방향성이 잡혀서 고민이 해결되지 않을까 싶습니다.
추가 실험을 했음에도 문제가 발생한다면, 다시 문의해주세요~
  • 레벨02 옥낭자 (과기인)
  • 26.07.03 11:16
Plate 코팅 문제입니다.
Plate 생산 lot을 바꿔서 다시 진행해보세요

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