이번에 처음으로 실험하고 gating 해봤는데, 구글링으로 찾은 이상적인 그래프랑 영 딴판으로 나와서 이걸 어떻게 해석해야 할지 모르겠습니다.. 초기 FSC/SSC로 debris랑 cell 구분부터 잘 안되고, sample 처리한 group 중 하나는 live랑 early apoptosis가 한 덩어리로 나와서 어디를 gating 기준으로 잡아야 할지 모르겠습니다.. 세포주는 HCC44라는 세포주 사용중이고, 약물 처리는 72시간 잡고 하는중입니다. 처리 시간도 길고 세포가 좀 커서 그런지 이전에 쓴 A549랑은 조건부터 다른거같아서 너무 어렵네요.. FACS 잘 아시는분들께 질문드려봅니다... 혹시 몰라서 제가 실험한 파일도 올려뒀습니다..
1. All event에서 Voltage는 FSC-200, SSC-300으로 뒀습니다. Voltage부터 다시 설정해야 하는걸까요? FITC랑 7-AAD는 각 300으로 두고 했습니다
2. SE 샘플을 먼저 찍고, CTRL은 맨 마지막으로 찍었습니다. 보관 조건이 나온게 없어서 RT, 암조건으로 보관하고 사용한 샘플인데, 이것도 영향이 있을까요? 새로 실험하면 cold rack에 보관해서 사용해보려고 합니다..
3. cell counting 해서 최대한 농도를 동일하게 맞추고 진행했는데 all event count를 보면 들쭉날쭉합니다.. 이것도 최대한 통일하는게 맞을까요? PBS에 희석된 샘플을 trypan blue로 stain하고 cell counter 사용중입니다. dead는 뭔가 인식을 잘 못하더라고요..
4. harvest할때 트립신 200uL씩 처리하고 PBS로 회수 후 센트리했었습니다. 초기 회수 때 media를 사용하는 것이 맞을까요? 아니면 트립신 말고 cell scrapper로 회수하는게 맞는걸까요?
5. 샘플 염색 후 다시 센트리해서 상등액 제거 후 4% 포름알데히드로 고정하는 방안도 고민중입니다.. Tonbo 사의 FITC Annexin V Staining Kit 사용했어요
