gel extraction 시 A260/A230 이 너무 낮게 나옵니다.. | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q gel extraction 시 A260/A230 이 너무 낮게 나옵니다..

레벨02 초콜릿좋아 (대학원생)

26.06.03 21:51
조회363

안녕하세요.

DNA ligation 후 Sanger sequencing을 의뢰하고자 하는데, gel extraction 이후 DNA 농도와 순도가 매우 낮게 측정되어 조언을 구하고자 합니다.

저는 재조합 유전자를 pET28b(+) vector에 ligation한 후 E. coli DH5α에 transformation하였습니다. 이후 삽입 여부를 확인하기 위해 colony PCR을 수행하였고, 예상 크기인 약 1.4 kb 위치에서 밴드를 확인하였습니다. 그러나 동일한 시료에서 약 700 bp 크기의 추가 밴드도 함께 나타났습니다.

현재 ligation 결과를 확인하기 위해 1.4 kb 밴드를 절취하여 gel extraction을 진행한 뒤 Sanger sequencing을 의뢰하려고 하였으나, 추출된 DNA의 농도와 순도가 매우 낮게 측정되고 있습니다. NanoDrop 측정 결과 농도는 대부분 20 ng/μL 이하였으며, A260/A230 값도 약 0.3 수준으로 나타났습니다.

사용한 gel extraction kit는 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)이며, protocol은 제조사 권장 방법에 따라 수행하였습니다.

또한 전기영동 시 PCR product + loading dye 샘플을 각 well에 10 ul 씩 로딩하였고, gel fragment 6~7개를 사용하여 gel extraction을 진행하였습니다.

궁금한 점은 다음과 같습니다.

Gel extraction 후 DNA 농도와 순도가 낮게 나오는 원인이 무엇일까요?
Gel extraction 효율을 높이기 위해 주의해야 할 점이나 개선 방법이 있을까요?
현재와 같은 농도 및 순도 조건에서도 Sanger sequencing 의뢰가 가능한지 궁금합니다.

NanoDrop 측정 결과는 아래 표와 같습니다.

조언 부탁드립니다. 감사합니다.

Mol. Biol.-DNA > Purification/Isolation

등록순
추천순

A 답변 14

레벨05 biotech25 (과기인)
26.06.03 22:39

일단, Gel 조각을 ~7개나 모은다고 했는데, 너무 많아요. Column에서 처리할 수 있는 양이 보통 < 350 mg입니다. Gel 양을 줄이고, DNA Band 는 정확하게 절제해야 합니다. 그러기 위해서는 처음부터 전기영동 시작할 때, DNA 를 좀 많이 loading 해 보세요.

Wash buffer에 남아 있는 에탄올이 완전히 마르지 않은 상태에서 elution을 하면 농도, 순도 모두 떨어집니다.

답변리플

레벨02 초콜릿좋아 (대학원생)
26.06.03 23:30
질문자

답변 감사합니다.

저는 한 well에 적어도 dna가 9 ul 정도는 로딩이 될 것이라고 생각하는데 이것보다 더 로딩하는 것이 좋을까요?

gel 개수는 줄이고 한 well에 로딩하는 dna의 양을 늘리라는 말씀으로 이해했는데 이게 맞을까요?

레벨08 강시 (과기인)
26.06.04 09:12

transformant가 나왔으니 PCR로 고생하지 마시고 plasmid 를 뽑아서 제한효소로 잘라보세요.

그게 더 정확합니다.

답변리플

레벨02 초콜릿좋아 (대학원생)
26.06.04 14:03
질문자

답변 감사합니다.

제한효소 처리한 샘플을 sanger sequencing 맡겨도 괜찮나요?

레벨02 도흐 (대학원생)
26.06.04 11:16

저희 연구실 같은 경우에는 well 사이 빈틈에 테이프를 붙여서 하나의 긴 well을 만들어서, loading dye + DNA가 총 30 μl 정도가 되도록 한 다음에 gel extraction을 합니다.

그리고 경험 상 nanodrop도 너무 낮은 농도의 DNA는 정확하게 측정하지 못하는 경향이 있어요. gel extraction 후에 다시 agarose gel에 걸어봐서 육안으로 밴드가 보이는지 확인해보셔야 할 거 같아요.

답변리플

레벨02 초콜릿좋아 (대학원생)
26.06.04 14:06
질문자

답변 감사합니다.

gel extraction 후 전기영동하여 밴드는 확인했어요.

그런데 A260/A230이 낮을 경우에는 시퀀싱이 잘 안 될 수도 있다고 해서 샘플을 다시 만들어야 할지 고민중입니다ㅜ

레벨02 도흐 (대학원생)
26.06.04 17:20

아...근데 ligation 후에 colony가 떴고, 그걸 colony PCR로 확인하신 그 product를 gel extraction해서 시퀀싱하신다는 뜻이었네요.

그럼 그냥 플라스미드 뽑아서 바로 sanger sequencing하면 되지 않나요? 어차피 colony PCR은 말 그대로 확인하는 용도고, 제대로 클로닝이 됐는지 확인하려면 그냥 플라스미드 뽑아서 바로 sequencing 보내면 될 것 같은데...

굳이 colony PCR product를 시퀀싱해야 할 이유가 없을 것 같아요. 플라스미드를 뽑아서 insert를 다시 제한효소로 잘라서 시퀀싱할 이유도 없고요.

레벨02 초콜릿좋아 (대학원생)
26.06.04 17:52
질문자

아.. 플라스미드를 sanger sequencing 맡기면 많이 복잡해지지 않나요?

제가 알기로 sanger sequencing은 600~800 bp 정도만 가능한 것으로 알고 있는데, 그렇다면 plasmid sanger sequencing용으로 primer를 다 짜야하는 게 아닐까 싶은데 아닌가요..?

지금은 T7 promoter, T7 terminator 서열로 colony PCR 한 샘플을 시퀀싱 맡기려는 거에요

레벨02 도흐 (대학원생)
26.06.04 18:14

음 본문 읽어보니까 insert가 1.4 kb인거죠?

그럼 forward primer와 reverse primer로 750 bp씩만 읽어도 충분히 overlap해서 전체 서열을 읽을 수 있을 것 같은데요?

그리고 종종 insert 사이즈가 크면 우선 5' 방향부터 시작해서, 첫번째 시퀀싱 결과에서 어느 정도 서열을 읽어냈으면, 그 읽어낸 서열의 끝 부분에 다시 sequencing primer를 짜서 시퀀싱 보내고...그렇게 해서 3 kb나 4 kb를 읽는 경우도 봤어요. 근데 1.4 kb 정도면 앞뒤로 각각 읽어서 한번에 끝낼 수 있을 것 같은데요?

레벨02 초콜릿좋아 (대학원생)
26.06.04 18:27
질문자

제가 잘못 이해했던 것 같아요

덕분에 궁금증이 해결됐습니다. 감사합니다!!!

레벨01 백신연구원 (과기인)
26.06.04 13:12

근데 실험 목적이 서열정보 확인이면 그냥 miniprep해서 sequencing을 보내는 게 더 정확하실 겁니다. taq이 관여하면 아무래도 에러가 생길 확률이 제품에 따라 있으니까요.

그리고 PCR product라서 그 정도 quality여도 sequencing 의뢰하면 결과는 나오긴 했던 거 같습니다.

답변리플

레벨02 초콜릿좋아 (대학원생)
26.06.04 14:09
질문자

답변 감사합니다

제가 이전에 동일한 시료를 시퀀싱 맡겼던 적이 있었는데, 그 때는 PCR product를 클린업 한 후 농도 및 순도가 정상범위에 있는 샘플을 맡겼던 적이 있습니다. 그런데 이 때는 시퀀싱이 제대로 되지 않았었고, 밴드가 두 개라서 안 된 것이라고 판단하여서 이번에 맡길 때에는 gel extraction을 하고 시퀀싱 맡기려고 했습니다.

레벨08 SPEED (일반인)
26.06.04 16:56

그냥 plasmid를 분리해서 염기서열 분석하세요.