RAW 264.7 cell을 이용한 M1 및 M2 분화 문제 | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q RAW 264.7 cell을 이용한 M1 및 M2 분화 문제

레벨01 sinarae333 (대학원생)

26.05.30 10:18
조회172

안녕하세요 선생님들

현재 석박사 3기 진행중인 대학원생입니다.

제 프로젝트에 RAW264.7을 이용하는데

현재 M1 및 M2 분화의 integrity 와 재현성이 낮아 질문드립니다.

현재 저는
M1은 100 ng/mL LPS + 20 ng/mL INF-gamma 를 CDMEM으로 희석하여 M0 cell에 24h 처리하고

M2는 40 ng/mL IL-4를 CDMEM으로 희석하여 M0 cell에 24h 처리합니다.

M1 과 M2의 morphology는 확실히 바뀌지만

문제는 이렇게 분화시킨 M1의 세포 내 ROS level과 CD86의 발현이 재현성이 떨어지고

M2의 경우에는 CD206이 IF상에서 보이지 않습니다.

혹시 선생님들의 RAW 264.7 cell의 분화 팁이 있거나 조언을 구하려 질문 드립니다.

감사합니다.

#Differentiation

Cell Biology > Differentiation/Proliferation

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A 답변 4

레벨01 LY1731578 (과기인)
26.05.31 17:19

what kind of FBS did you use? FBS can activate RAW cells, so heat-inactivated FBS is recommended for culturing.

답변리플

레벨01 sinarae333 (대학원생)
26.05.31 18:10
질문자

Hello LY1731578,

Thank you for reply to my question.

I use CAPRICORN scientific FBS

But when i see the morphology and WB result,
Just raw264.7 cell that is incubated same period compared to M1 or M2 with 10 % FBS DMEM
There is no morphology change and M1 or M2 marker expression (CD86, iNOS, CD206, Arg-1)

The main problem is M1 differentiation intensity is inconsistent

Thank you

채택된 답변입니다.
레벨05 G.P.Ts (과기인)
26.06.01 08:23 (수정)

되도록 RAW 세포는 계대수(Passage)가 P12~15를 넘으면 분화능이 급감하므로 반드시 낮은 계대를 사용하세요.
실험시 confluency를 60~70%로 일정하게 유지하세요. 너무 꽉 차면 분화가 잘 안 됩니다.
RAW는 CD206 발현이 약할 수 있으므로, IL-4를 48h 처리하거나 Arg-1을 마커로 검출해 보세요.

특정 시간만 처리하시기보다 시간별로, 처리 농도별로 세팅을 먼저 해 보시면 어떨까 싶습니다.

그리고 IF 전에 PCR로 해 보시면 좋겠어요.

잘 하고 계시겠지만, IF던 PCR이던 항상 negative, positive control 군도 함께 포함시켜 확인해 보시면 좋겠어요.

참고 하시면 좋을 것 같아 공유합니다.

https://buly.kr/G3FR5cP

잘 해결 되시기 바랍니다.