pET24a vector 에 target gene (약 700bp)을

double digest -> prep(컬럼 정제) -> 비율 계산 후 ligation -> Transformation 의 과정으로 cloning 하는 실험을 진행 중입니다. 

문제는 크게 3가지 입니다.

1. 동일 프로토콜을 수행함에도, 최종 transformation 이후, 콜로니의 개수가 상대적으로 작습니다(10개 내외; 일반적으로 30~40개 정도의 콜로니가 뜨는 프로토콜입니다)

실험 과정에서의 핸들링 차이가 있었겠지만, 정확히 어느 단계에서 그 차이가 발생했는지 감이 잘 잡히질 않습니다..
다른 사람과의 두드러지는 차이가 있다면, 벡터의 농도가 옅은 편이었고, 벡터와 target gene의 농도 차이에 따른, ligation 비율의 차이가 있었습니다. 

2. 위양성의 비율이 높습니다. plate에서 뜬 콜로니를 모두 취하는게 아닌, 그 중 일부만 선택해서 colony PCR을 진행합니다. primer는 target gene을 증폭시키도록 설계된걸 사용하며, colony PCR 결과, 양성 비율은 50%가 최대였습니다.

3. colony PCR 결과 양성이었던 colony를 prep 후, one-cut digestion을 진행했고, 본 벡터를 one-cut한 것과 같이 전기영동을 내려보았습니다. 그런데, 일반 pET24a 벡터와 그 크기가 같았으며, 이는 공벡터였음에도 colony PCR에서 target gene이 검출되었음을 시사합니다.


위와 같은 문제가 반복적으로 발생합니다... 나름 벡터 농도를 높히기도 했으나 colony 개수 차이가 크지 않았고,
공벡터의 비율이 높았던 이유가 digestion의 문제일까 싶어 digestion 이후, ligation을 진행하지 않고 transformation을 진행했을 땐 콜로니가 거의 뜨지 않았습니다..

궁금한 건 다음과 같습니다...

1. 콜로니 개수가 낮은것, 위양성의 비율이 높은 것 모두 벡터의 농도가 낮은게 가장 문제일까요? 전기영동 상으로 확인했을 땐 10~12ng/ul 정도로 추정했습니다. cloning 시 몰 비율은 1:5=vector:target gene 으로 설정했었구요.

2. mini-prep 과정에서 pellet을 농축하는 것 외에 벡터 농도를 높일 수 있는 handeling 요소가 무엇이 있을까요? 개인적으로 개선했던 건 lysis 단계에서의 inverting 강도였습니다.

3. target gene이 없는 vector임에도, colony PCR에서 target gene이 검출될 이유가 무엇일까요? 간혹 콜로니를 따는 과정에서 배지를 긁고, 그때의 target gene 조각이 첨가 되어 검출될 수 있다는 케이스 외에, 다른 케이스도 있나요? 단순히 contam으로 취급하기에는 밴드가 너무 선명하게 나온 경향이 있어서 여쭤봅니다..

첨부드린 사진은 colony PCR 결과이며, 오른쪽에서 세번째에 로딩했던 콜로니를 prep 해서 전기영동을 또 내린 결과, 위양성이었습니다.

부족함 많은 대학생이지만... 부족함이 많아 도움이 간절합니다. 염치없지만 답글 부탁드립니다 ㅜㅜ 감사합니다.