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Q DNA cloning 질문

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레벨01 초콜릿좋아 (대학원생)

  • 26.02.04 19:10
  • 조회185
안녕하세요 DNA cloning 진행중인 학생입니다.

다름이 아니라 transformation 이후 colony PCR 진행했을 때 밴드가 여러 개 형성되어서 질문 남깁니다. 

제 실험 과정과 조건을 먼저 말씀드리겠습니다. 
PCR 증폭 -> double enzyme digestion -> clean up -> ligation -> transformation -> colony PCR -> electrophoresis 

msfGFP gene (714bp)을 업체에 의뢰하여 합성한 것을 PCR 증폭하였습니다. 
이후 PCR 증폭된 산물과 expression vector인 pET28b(+)를 BamHI, NdeI으로 double enzyme digestion 하였고,
ligation 하기 전에 clean-up을 진행하였습니다.

클린업 결과는 다음과 같습니다. 

msfGFP
pET28b(+)
Concentration
22.70 ng/ul
11.65 ng/ul
A260/A280
2.078
2.284
A260/A230
0.901
0.486

위 산물을 이용하여 T4 DNA ligase 사용하여 RT(23°C)에서 5분간 ligation 진행하였습니다. 
ligation 조건은 아래와 같습니다.
Molar ratio of vector DNA and insert DNA = 3 :1
compositionvolume(20ul)
10x Ligation buffer2 ul
vector DNA (digested pET28b(+))4 ul (44.6 ng)
insert DNA (msfGFP)0.842 (18.5 ng)
SDW12.158
T사 T4 dna Ligase1 ul

이후 E. coli DH5a competent cell에 transformation 하였고, 이후 colony가 형성되어서 colony PCR 진행하였습니다. 전기영동 결과는 첨부해두었습니다. 
colony PCR 조건도 함께 남기겠습니다. 

먼저 needle을 이용하여 colony를 취하여 10 ul의 FDW에 현탁한 뒤 95°C에서 boiling 하였습니다. 
그러고 나서 아래 composition과 condition으로 colony PCR 진행하였습니다.

compositionvolume
master mixFDW14.3 ul
master mix
2.5 mM dNTP mixture1.6 ul
master mix
10x Ex Taq Buffer
2 ul
master mix
T사 Ex Taq polymerase
0.1 ul

10 μM T7 promoter
0.5 μL (0.25 μM)

10 μM T7 terminator
0.5 μL (0.25 μM)

Template DNA
1 ul

단계Temperature(°C)Time(sec)Cycle
Initial denaturation953001
denaturation953030
annealing613030
extension726030
final extension723001
storage4무한1

colony PCR 했을 때 1kb 근처에서 밴드가 형성되어야 하는데,
1) 단일 밴드도 아니고
2) 밴드가 1 kb에서 형성되지 않았습니다.

이전에 다른 sample을 transformation 한 후 colony PCR을 진행했었는데, 단일 밴드가 나오지 않은 것은 처음이라서 어떤 것이 문제인지 여쭤보고 싶어서 질문 남깁니다. 
(참고로 실험에 사용한 시약은 모두 정상입니다.)

추가로 첨부파일의 1, 10번 샘플의 콜로니로 streaking하여 incubation한 후 이를 이용하여 colony PCR 진행했는데, 이 때는 밴드가 전혀 나타나지 않았습니다. 이 것의 이유에 대해서도 알려주시면 감사하겠습니다. 

질문을 정리하자면
1. transformation 이후 colony PCR 전기영동에서 밴드가 여러 개 형성되었음. 원인 + 해결 방안 
2. transformation 된 colony를 계대배양한 후 진행한 colony PCR 전기영동에서는 밴드가 형성되지 않았음. 이유
DNA cloning 질문

Microbiology > Virus

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A 답변 4

  • 레벨08 SPEED (일반인)
  • 26.02.05 06:51
colony 수가 적으면 prep.한후 잘라서 확인하는것이 정확합니다.
  • 레벨01 초콜릿좋아 (대학원생)
  • 26.02.05 11:00
  • 질문자

안녕하세요. 답변 감사합니다.

Transformation 후 colony는 약 10개 정도 형성되었습니다. 저는 insert 삽입 여부를 확인하기 위해 colony PCR을 먼저 진행했습니다.

혹시 말씀하신 “prep 후 잘라서 확인”은, colony PCR 대신 각 colony에서 plasmid를 miniprep으로 추출한 뒤 restriction enzyme digestion으로 빈 벡터와 insert 포함 벡터를 구분해 보라는 의미가 맞을까요?

또한 제 insert는 714 bp라서, digestion 후 전기영동에서 밴드 차이가 뚜렷하지 않을 수 있을 것 같아 걱정됩니다. 이런 경우 삽입 여부를 더 확실히 확인할 수 있는 추천 방법이 있을지 조언 부탁드립니다.

감사합니다.

  • 레벨05 푸른고래 (과기인)
  • 26.02.05 14:33
1. transformation 이후 colony PCR 전기영동에서 밴드가 여러 개 형성되었음. 원인 + 해결 방안 
-> 목적밴드의 사이즈가 아닌 경우라면 무시하면 됩니다. 클로닝이 제대로 이루어지지 않아서 그런듯 싶어요

2. transformation 된 colony를 계대배양한 후 진행한 colony PCR 전기영동에서는 밴드가 형성되지 않았음.
-> colony PCR을 할 경우 배지에 도말된 ligation 산물이 PCR 되기도 합니다.  배양 후 추출한 plasmid로 PCR을 한 것이 더 믿을만한 결과입니다.
  • 레벨01 초콜릿좋아 (대학원생)
  • 26.02.05 14:36
  • 질문자
답변 감사합니다!

cloning을 다시 해봐야겠네요

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