PCR 전기영동 결과 해석 방법 | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q PCR 전기영동 결과 해석 방법

레벨01 kong00 (대학생)

26.01.30 19:03
조회382

안녕하세요 학부인턴생 입니다.

PCR 전기영동 결과 관련해서 어떻게 해석을 해야하는 것인지 찾아봐도 나오지 않아서 이렇게 질문을 남기게 되었습니다.

제대로 결과가 나온 것은 아니지만,

보라색 부분은 dye가 내려오면서 생긴 부분

노랑색 부분의 진한 곳은 DNA 밴드라고 해석하면 되는 것일까요? 혹시 DNA = dimer 이라고 해석하는 것이 맞나요? 사수님이 dimer도 안보이네 라고 하셔서 혹시 그게 그 말인게 맞는지 해서요

마지막으로 녹색 부분(검은 그림자 같은?)과 파랑 부분(하얀색 무언가?) 는 해석하는 부분이 아닌 것인가요?

이런거 관련해서 혹시 배울 수 있는 영상이나 사이트를 알고 계시다면 알려주시면 매우 감사하겠습니다ㅜㅜ

오늘 여쭤봤어야 했는데 사수님께 여쭤보지 못하고 퇴근하는 바람에, 월요일까지 궁금해서 못 기다릴 것 같고 지피티가 알려주는 정보가 확실하지 않은 것 같아서요..

+추가적으로 설명을 덧붙이자면,

10^7, 6, 5, 4의 DNA를 2반복씩 하고 마지막에 negative 2개 내린 결과입니다

Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR

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A 답변 4

채택된 답변입니다.
레벨06 뭉이아빠2 (과기인)
26.01.31 08:13

보통 primer dimer의 경우 size marker(100bp ladder기준) 보다 아래쪽에 위치합니다.

size marker 아랫부분이 좀 깔끔하지 않고 끌렸네요.

negative 2개 샘플 내린 결과를 보면 primer dimer가 보입니다. template 안넣은 샘플인가요?

1. 보라색부분은 primer dimer라고 생각하면 될것 같습니다.

2. 노란색 부분은 타겟부위 증폭된 결과로 해석하면 되고..

3. template가 plasmid인가요? 파란 부분은 template로 사용한 plasmid아닌가 생각됩니다.

주형으로 사용하는 plasmid를 reaction 샘플에 많이 넣으면 저렇게 보일 수도 있겠네요.

그런데 negative lane에서도 보이는것으로 봐서.. 비특이적 증폭일 수도 있을것 같습니다.

이부분은 실험조건을 달리해서 원인을 찾아보셔야 할것 같네요.

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레벨01 kong00 (대학생)
26.01.31 23:42
질문자

안녕하세요 답변을 매우 기다리고 있었는데

, 남겨주셔서 감사합니다.

일단 저도 이게 정확히 어떤 샘플인지 알고 받은 것은 아니고 연습해보라고 받은

10^7,6,5,4 각각의 DNA였는데 아마 plasmid가 아닐까 라고 생각합니다.!

negative 경우, 둘다 DNA 넣지 않고 DW를 넣었습니다!

primer 같은 경우에도 그냥 주시는 거 받아서 넣은거라 실험 조건 자체가 잘못 되었을 수도 있겠네요..

혹시 dye 같은 경우에는 이 전기영동 결과와 관련이 없는 것이 맞나요? 지피티에게 물어봤을 땐 맨 아래 내려온게 dye 어쩌고 이야기를 하는데 헷깔려서요..! 원래 dye는 DNA 결합해서 어디까지 내려갔는지 보여주는 역할이라고 봤던 것 같은데

지피티는 보라색 부분이 dye라고 하네요ㅜㅜ

답변 주셔서 정말 감사합니다

레벨06 뭉이아빠2 (과기인)
26.02.01 11:38

DNA running에 사용되는 loading dye 성분들을 보면 DNA랑은 직접적인 연관은 없습니다.

구매해서 사용할 수도 있고 직접 만들어 사용할 수도 있습니다. 보통은 glycerol과 Bromophenol Blue, Xylene 등이 포함되어 있습니다.

glycerol의 경우 DNA가 agarose gel의 시작부분인 구멍(well)에 잘 내려 앉게 하는 역할을 합니다.

그리고 BPB, Xylene등은 그냥 DNA랑은 상관없이 agarose gel 상에서 전기를 줬을때 이동이 됩니다.

정확하진 않지만 BPB는 DNA와 비교하면 약 4~500bp 정도 위치로 내려갑니다. xylene의 경우 4kbp~5kbp 정도의 위치로 내려가고요.

예를 들어 내가 볼려는 DNA 사이즈가 300bp라면.. gel 상에서 BPB가 빠져나가 버리면 내가 볼려는 DNA도 gel에서 빠져나간다고 생각할 수 있습니다.

그래서 BPB 와 같은 dye의 이동 정도를 보고 전기영동을 종료하는 시기를 결정합니다.

저는 보통 BPB가 gel의 맨아래에서 3칸정도 위치했을때 종료합니다.

아주 작은 size의 DNA를 볼때는 그보다 일찍 종료하고요.

레벨08 강시 (과기인)
26.02.02 09:13

우산, 봐야 할 것은 기대하는 PCR product의 크기입니다.

기대되는 크기의 DNA 밴드만 보면 되고,

나머지 다른 잡밴드들은 분석대상이 아닙니다.

다만, 기대하는 DNA 밴드는 양이 너무 적고 잡밴드 단백질의 양이 과하게 많으면 primer의 nonspecific binding이 많은 것이므로 annealing temperature를 조절해서 optimization 하야 합니다.

보여주신 젤사진에서 노란 위치의 DNA 밴드가 원하는 크기겠죠?

그런데 보라색 위치가 primer dimer라면 증폭된 DNA 가 많으면 primer dimer가 적어야 하고,

반대로 증폭된 DNA가 적으면 primer dimer는 양이 상대적으로 많아야 하는데 젤사진에서 보면 그렇지 않습니다.

왜그럴까요?

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