mCherry protein Purification 질문 (E.coli system) | 실험 Q&A > 커뮤니티

Q mCherry protein Purification 질문 (E.coli system)

레벨01 빙무빙 (대학원생)

26.01.28 15:28
조회256

안녕하세요. 제가 거의 1년 넘게 mCherry protein을 발현시키고 있는데, 좋은 purity의 결과를 얻지를 못해서 혹시 저와 같은 경험을 해보신 분이 있을까 싶어 여쭈어봅니다.

mCherry에 다른 단백질을 붙여서 recombinant protein(His tag 포함)을 제작해 얻어내고 있는데, protein 자체는 E.coli (BL21(de3)) system에서 overexpression이 잘 되고, 잘 얻어집니다.

근데 문제는 mCherry protein의 truncated fragment로 유추되는 2개의 minor band가 계속 관찰된다는 것입니다.

해당 impurity fragment를 거르기 위해 SEC, Anion exchange, Histrap, Denaturing condition SEC, protease inhibitor 등 저희 방에서 할 수 있는 모든 수단을 다 사용해본 것 같으나 유의미한 개선을 얻은 적은 없는 것 같습니다....

mCherry protein에 대해 찾아보면 RFP 류가 unstable하여 fragmentation이 관찰된다라는 말을 심심치 않게 보기는 하는데, 주로 protein이나 Ab 판매회사에서 product 설명을 위해 적어놓은 note의 한 문장일 뿐 정확한 reference나 관련 data를 얻을 수가 없습니다...

mCherry protein은 E.coli에서 정제해 얻는 것보다 mammalian으로 transfection하여 monitoring하는 연구가 더 많아서 정제해 얻은 data도 좀 한정적인 것도 같구요...

혹시 저와 비슷하게 mCherry(혹은 그 외 다른 형광단백질) 정제에 있어 어려움을 겪은 경험이 있는 분이 있을까하여 QnA를 올립니다...

그 외 단백질 정제 관련해서 조언해주셔도 감사한 마음으로 참고하도록 하겠습니다.

감사합니다.

Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification

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A 답변 3

채택된 답변입니다.
레벨02 브하하 (일반인)
26.01.30 12:35

1. 시퀀싱은 해봤나요? mutation은 없었나요.

2. truncated fragment 라고 생각하는 근거는 뭔가요? 단순히 SDS-PAGE에서 band가 확인된 것?
3. size가 있으면 같이 고민할 수 있을 것 같습니다. mCheery, 관심 단배질, fusion 형태, 관찰된 band 크기

답변리플

채택된 답변입니다.
레벨05 SCIENTIST00 (과기인)
26.02.02 19:31

mCherry의 truncated fragment로 유추되는 2개의 minor band

: 여기서 질문드립니다.

1. 유추된다고 하셨으니 ms로 확인해보신것은 아닌 것 같군요. fusion protein일 가능성을 고려해보세요.

2. minor band가 후속 실험에서 꼭 제거되어야 하는건가요?구조연구가 아니면 그 정도의 고순도는 필요없기에 적었습니다.

답변리플

레벨01 빙무빙 (대학원생)
26.02.13 14:49
질문자

이 이후로 실험을 어느 정도 해보고 reference 탐방을 했는데 제 고민이 어느정도 해결된 것 같아서 답글 작성합니다.

우선 제 단백질은

1. seq 상 mutation없음 seq check완료

2. fragmentation은 sds와 MS로 둘 다 확인을 하였고, mCherry의 chromophore에서 fragmentation이 일어난 뒤 각각의 fragment에 해당하는 사이즈가 sds와 MS상에서 동일하게 관찰되었습니다.

3. 후속 연구에는 문제가 없을 이슈라고 개인적으로 생각하나, 교수님께서 후환을 남기지 말자는 의견이셔서 해결법을 찾고 있었습니다.

제 연구의 현 문제점은 mCherry의 stability였는데, 찾아보니 mCherry의 조상이라 할 수 있는 DsRed 자체가 chromophore가 stable하지 않아, denaturation condition(SDS sampling 혹은 MS)에서 H2O가 추가되어 fragmentation이 발생한다는 reference가 있었습니다. 이에 DsRed와 유사한 RFP류들이 전반적으로 unstable했던 것이구요. - DsRed의 이러한 특성에 대한 논문은 금방 서치해도 나옵니다.

혹시 저와 같이 RFP - E.coli system expression에서 어려움을 겪는 분이 있을까 싶어 글을 추가로 남깁니다.