Q

안녕하세요, 분석 실험을 처음 하게 된 초보입니다. 식품을 hexane으로 탈지해서 단백질을 추출한 후 동결건조한 가루를 대상으로 GC-FID를 이용해서 잔류 hexane양을 검출하는것을 목적으로 method들을 찾아봤습니다. 대부분 headspace sampler를 이용한 method들이 많았지만, 실험실 여건상 불가하여 direct injection 방법을 위주로 찾았고, 다음의 파프리카추출색소에서 잔류용매를 검출하는 방법을 선택했습니다. 아래 url은 해당 method 원문입니다. https://various.foodsafetykorea.go.kr/fsd/#/ext/Document/FA?searchNm=%ED%8C%8C%ED%94%84%EB%A6%AC%EC%B9%B4&itemCode=FA0A024003004A534 해당 칼럼과 기기의 조건은 맞지만, carrier gas 공급에서 막혔습니다. 실험실에 N2 공급 라인은 있지만 항상 carrier gas로 helium을 사용했어서 연결한 적이 없었습니다. 그리고 N2를 사용하기 위해서는 EPC module이 필요하다고 했는데, 비슷한게 보이기는 하나 기사님이 확인하러 오셔야한다고 했습니다. 그래서 원래 method에서 사용한 N2 대신 helium을 carrier gas로 진행할 수 있을지 고민하다 쉽사리 결정하기 힘들어 선배님들께 묻게 되었습니다. 1. GC fid에서 기존 method의 carrier gas와 makeup gas인 N2 대신 helium을 사용해도 좋은 resolution이 나올지 궁금합니다. 2. method와 논문을 찾아봐도 h2와 air zero, make up gas의 유량 언급이 없는데, detector에 맞는 유량 조건이 있는지 궁금합니다. 몇주간 끙끙대며 알아보려고 했지만 결과가 잘 나오지 않아 부탁드립니다. 감사합니다..!

2023.12.06

Q

안녕하세요. 제가 이전에는 western을 하고서 밴드 현상한 data만 논문에 썼었는데요 논문들 보니까 수치화도 많이들 하시더라구요. 근데 수치화 계산하는걸 안해봐서 궁금해서 질문드려봅니다. 각 band의 수치값은 얻었습니다. Control의 beta-actin, Total form, phospho form sample의 beta-actin, Total form, phospho form 이렇게 얻었다고하면 Control과 sample 각각 Total form/beta-actin=A, phospho form/beta-acti=B 나눠주면 끝인가요!? 아니면 여기서 나온 B를 A로 또 나눠줘야하나요?

2023.12.06

Q

첨부 사진은 곤충독소단백질 아닙니다 !!!!! 색만 봐주세요 제가 찾은 것들은 아래 사진처럼 푸른색이 나옵니다. 0.5% basic fuchsin 사용 파란색이 나올 수 없는 시약이라고 하던데 바실루스 곤충독소단백질은 원래 염색이 안되나요???? 아래 사진의 파란색은 뭘까요?

2023.12.06

Q

안녕하세요 현재 학부연구생입니다. 제가 현재 무세포 단백질 합성 기술을 통해 proteinG의 발현을 높이기 위해 N term에 fusion tag를 달고 있는 실험을 진행 중에 있습니다. 그런데 희한하게 western blot을 하면 only protein G 만 있는 단백질이 검출이 되지 않고 있습니다. 다른 fusion tag는 protein G PCR product를 overlap PCR을 통해 서열을 추가해주었는데.. 희한하게 TAG를 달아준 애들은 His probe direct western blot을 하면 band가 보이는데 protein G만 보이지 않으니 정말 답답합니다. 12% SDS PAGE 로는 발현을 확인하였습니다. 그런데 WB만 하면 이런 식으로 BAND가 나오니 고수님들 조언 부탁드립니다. 제가 놓치고 있는 부분이 어디가 있을까요? ㅠㅠ.. WB는 nitro cellulose 사용하였으며 his probe 4 mg/ml 3 ul 를 TBS-T buffer 15 ml 에 희석하여 사용하고 있습니다.

2023.12.06

Q

안녕하세요! 펩타이드 biotinylation 관련해서 궁금한 사항이 있습니다. Biotinylation 경험해보신 분들의 많은 답변 기다리겠습니다! 현재 1~4kDa 정도의 합성 펩타이드에 biotin을 붙이려고 합니다. 일반적으로 사용하는 NHS-biotin reagent kit(Thermo 사)를 사용하려고 하는데, protocol 읽는 도중 막히는 부분이 생겨 질문 남깁니다. (참고 매뉴얼 링크: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0017096_2162632_EZ_LinkNHS_PEG12_Biotin_UG.pdf) 1. Reagent volume 계산 식에서 예로 든 IgG의 경우 Mw이 150kDa이라서 2mg/ml, 1ml 기준으로 10mM Biotin reagent가 26.6ul 사용됩니다 (20 fold-molar excess 기준). 하지만 펩타이드의 경우 Mw이 1~4kDa이다보니 2mg/ml, 1ml 기준으로 5 fold-molar excess로 계산했을 때, reagent가 약 1ml이 필요하다고 계산됩니다. 이 경우, peptide와 reagent가 1:1로 들어가면서 1/2 dilution되고 생각보다 많은 양의 reagent가 필요하게 되더라구요. 다른 분들은 peptide biotinylation 할 때 peptide와 biotin ratio를 어떻게 하는지 궁금합니다! 2. Biotinylation할 때, N-terminal alpha-amine에만 biotinylation 되면 좋겠는데 중간에 들어있는 Lysine 잔기의 gamma-amine에도 biotinylation이 될 것 같습니다. Lysine 잔기에 biotinylation 될 경우 peptide 성능이 바뀌는지 알 수 있는 방법이 있는지, 혹은 N-terminal만 specific 하게 biotinylation 하는 방법이 있는지 궁금합니다!

2023.12.06

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안녕하세요. 6개월차 신입입니다. 이번에 pH 측정방법 SOP를 대한민국 약전을 바탕으로 개정하게되었습니다. 개정하기 전 pH calibration은 4.01 7.00 9.21 3개의 buffer를 가지고 calibration을 수행합니다. (pH meter기는 메틀러토레도 장비입니다.) 대한민국 약전을 참고하면, 2개의 buffer를 사용하고, 7.0 buffer를 먼저 측정하고, 검체의 pH 농도에따라 4.01 이나 9.21로 한다고 되어있는데 개정 전 방법의 근거는 장비 메뉴얼에 있어서 적용을 한것인지 궁금하고, 어떤 방법이 정확한지 궁금합니다. 중소기업에 선임분도 없으셔서 여쭤볼때가 마땅치않아 질문드립니다ㅜㅜ 도와주세요..

2023.12.06

Q

안녕하세요! AP-1 및 MMP-1으로 Transfection 된 HaCaT Cells을 이용하여 Luciferase 실험을 진행하고 있습니다. 제가 샘플의 Positive 군으로 처리한 Retinol(5uM)이 AP-1, MMP-1 Luciferase실험에서 UVB대비 증가하는 현상을 몇 차례 관찰했습니다. HaCaT Cell을 이용한 단백질 수준(Western blot)에서는 Retinol군이 감소하는데 왜 Transactivation은 Retinol이 증가하는 현상이 관찰되는지 궁금합니다. 미리 감사드리고, 연말 잘 보내세요!

2023.12.06

Q

안녕하세요 co-culture를 세팅중에 있는데 궁금한 점이 있어서 질문드립니다 ㅠ 현재 caco-2와 RAW264.7을 co-culture 진행중이고 caco-2를 hanging plate에 seeding하여 키우고 있습니다. 18~20일이 되는 날 RAW264.7을 아래쪽에 seeding한 후 LPS로 activation시킬 예정인데요. 정상적으로 염증유발이 되었는지 확인하기 위해 TNF-alpha를 ELISA로 확인하려고 합니다. 그런데 여기서 사용하는 배지는 caco-2를 배양한 배지인가요, RAW264.7 배양 배지인가요? - RAW264.7 배지를 이용하라고 하는데 LPS를 처리하면 co-culture가 아니더라도 TLR을 건드려서 염증이 유발될텐데.. 그럼 굳이 co-culture를 하지 않아도 괜찮은거 아닌가요? - caco-2배지는 이런경우에는 사용하지 않는다고 인터넷 검색 중에 보았는데, 진짜인가요? 그렇다면 왜 co-culture를 하는지..? - caco-2와 RAW264.7을 co-culture한 후 LPS로 activation을 유도했다면 caco-2의 배양액을 수거해야할 것 같은데 아닌가요?ㅠㅠ 도움 부탁드립니다..

2023.12.06

Q

안녕하세요. 이번에 RNA trizol 로 isolation 해서 젤로 전기영동 해서 18s 28s 관찰하려고 하는데 이와 관련된 protocol를 도저히 못찾아서 여기다가 글 올립니다... 어떻게 하는지 도저히 모르겠습니다.. RNA 농도를 최소 몇으로 넣어야 하고 dye는 어떤걸 사용해야하나요 어디글은 sybr gree도 사용한다는데 제품 사용설명서 보면 잘 안나와 있는것 같아서 답답합니다. 이와 관련된 protocol 알려주시면 감사하겠습니다 ㅜ

2023.12.06

Q

10uM solution을 50ml 용액에 얼만큼 넣어야 10uM의 농도를 만들 수 있나요?? 50ul 맞나요?

2023.12.06