Q

well에 마커/DNA/제한효소 처리후 DNA/ 제한효소 처리후 vector/vector 분주하였습니다 제한효소는 Nde1, xho1 사용하여 double cut 했습니다. DNA는 282bp, plasmid는 4407bp입니다. vector의 잘린크기는 18bp입니다. 제한효소처리는 1시간 진행하였고 8ul분주하여 전기영동하였습니다 (마커 2ul) 궁금한점은 이론적으로 제한효소 처리후 vector의 크기는 일반 vector보다 크기가 작아야된다고 생각하는데 결과는 일반 vector가 큰거같아서 의문입니다. 그리고 제한효소 처리한 DNA는 supercolied형태인데 이러면 잘리지 않은건 가요? 그리고 vector같은경우 좀 끌린거 같은데 제가 경험이 많이 없어 결과해석에 애를 겪고있습니다 도움주시면 감사하겠습니다.

2023.09.28

Q

안녕하세요? 저희 랩 자체가 마우스 브리딩이 처음이라 고수분들께 이렇게 여쭙게 되었습니다. 1. 상황 (1) 원하는 Tg (L +/+) 를 얻음 (2) 일단은 이 mouse line을 유지만 하고 싶음 2. 질문 (1) 어떤 기준으로 유지를 하는가? (예) 최소 6 breeding cage / 2~3 generation 포함할 것 (Jackson lab에 따르면..) (2) 위 기준으로 할 때, F0, F1로부터 너무 많은 새끼들이 생기는데 (이론적으로 3주에 한 번/cage), 이들을 어떻게 관리하는가..? (3) 아래와 같은 계획을 세웠는데, 혹시 조언주실 부분이 있으신지요? - F0 mating cage 1개, F1 mating cage 4개, F2 태어남. - F2가 2주까지 살아있으면 (4 male, 4 female), F0 sacrifice. - F2 4 mating cage 만들면 F1 mating cage 4개 중 2개 sacrifice. - 태어나는 놈들은 적당히 키우다가 weaning 전에 상황 보고 sacrifice. (상황이란게 아직은 잘 모르겠음..) 이 외에 조언 주실 부분 있으시다면 부탁드리겠습니다. 참고할만한 자료 주셔도 굉장히 도움될 것 같습니다. 감사합니다!!

2023.09.28

Q

안녕하세요. TEV protease를 이용해 전체 단백질(15kda)을 처리하여 tag(12kda)와 target peptide(3kda)으로 분리해서 3kda인 제 target 단백질을 sds-page에서 확인하는 실험 중에 있습니다. 지난번에 Tev protease처리 농도 조건을 잡기 위해 sample 대 TEV protease를 molarity ratio를 기준으로 다양한 농도로 처리했을 때는 다음 사진과 같이 12kda band가 잘 확인되었습니다. 다만 3kda인 제 target peptide는 band는 확인되지 않았습니다. 12kda band가 확인됐다는 점에서 tev protease 처리가 잘 이루어진 것을 알 수 있었으나, target peptide band(3kda)를 꼭 확인해야만 하는 상황입니다..! * A = TEV 처리 하지 않은 sample * B~F = TEV 처리 한 sample(농도별) 제 생각에 band가 확인되지 않는 이유는 1. 워낙 분자량이 작기 때문에 같은 농도에서 12kda은 band가 확인되지만 제 3kDa인 target peptide band는 확인이 안 되는 것 2. SDS-PAGE 진행 시 전기 영동 조건으로 16.5% tris-tricine gel에서 100V 40mA로 거의 100분 가량 내려주었기 때문에 3kda peptide는 diffusion되어 band가 확인되지 않는 것. 이 두가지 정도입니다. 이때 사용한 TEV protease는 EDTA를 0.5mM로 처리하고 일주인간 냉장고에 보관해두었던 것을 사용했었습니다. 그런데 이번에 본 실험에서 동일한 농도로, 같은 TEV protease로 sample을 처리해주었으나, TEV protease 처리가 일어나지 않았습니다...ㅠ 이번에 달라진 점은 농축을 진행한 점과 sds-page 전기영동 조건을 다르게 했다는 부분을 제외하고는 없었습니다. 달라진 점 1. 제가 이후 과정의 편의를 위해 ammonium sulfate로 sample을 1/20 부피(100mL >>> 5mL)로 농축을 진행했습니다. 70% ammonium sulfate로 침전시킨 단백질을 투석을 진행하여 ammonium sulfate를 제거한 후, 8M urea, 20mM Tris(pH 7.4) 5mL에 다시 resuspend한 후 8배 희석을 진행하여 (urea를 희석하기 위해) sample을 40mL로 부피를 만든 후 TEV protease를 처리했습니다. 달라진 점 2. 저는 지난번에 잡은 TEV protease 처리 농도 조건으로 그대로 TEV protease를 첨가하여 25도에서 O/N 처리했습니다. 곧바로 SDS-PAGE를 할 수 있는 상황이 아니여서 2~3일 정도 냉장보관 후 SDS-PAGE를 내려보았는데요. 아무래도 band가 확인되지 않는 것이 diffusion이 가장 큰 원인인 것 같아서 저분자 peptide는 낮은 전압에서 긴 시간 sds-page를 진행해야한다는 것을 알고 있었지만 단시간으로 빠르게 내리되, band끼리 차이가 벌어질 수 있을 정도의 적당히 고전압에서 짧게 전기영동을 진행하면 diffusion이 덜 되지 않을까 싶은 생각에 140V 100mA에서 1시간 진행을 해주었는데 결과적으로 band가 15kda에서 확인되었습니다. 때문에 저는 TEV protease 처리가 되지 않았다고 보고 있는데요. 일단 SDS-PAGE에서 target band가 확인되지 않는 문제도 해결해야 되지만, 그건 일단 뒤로 미루고 갑자기 TEV protease 처리가 되지 않는 이유를 도통 모르겠습니다..ㅠㅠㅠ TEV protease를 오늘 다시 재처리하고자 하는데 저는 TEV protease 활성이 일단 주요 문제라고 생각하고 있습니다..ㅠ 때문에 TEV protease 효소 활성을 돕는 DTT와 EDTA를 각각 1mM, 0.5mM이 되도록 다시 처리해주는 방법밖에는 생각이 나지 않는데, EDTA와 DTT를 다시 처리해서 동일한 sample에 다시 처리해봐도 될까요..? 조언 부디 꼭...! 얻고 싶습니다 (sds-page에 대해서도 가능하시다면 조언 부탁드립니다..!) 긴 글 읽어주셔서 감사합니다 항상 브릭을 통해 도움 많이 받고 있습니다. 하시는 실험도 다 잘 되시고 즐거운 한가위 보내시길 바랍니다..!

2023.09.27

Q

안녕하세요. salkowski solution을 제조하려고 하는데요. H2SO4, H2O, FeCl3·6H2O를 섞는데 FeCl3·6H2O가 다 녹지 않고 건더기처럼 떠다닙니다. 어느정도 섞은 후에 필터로 걸러낸 후 사용해야하나요? 답변부탁드립니다.

2023.09.27

Q

안녕하세요 현재 실험에서 collagenase와 DNase를 넣은 RPMI media를 사용하려고 하는데 실험 텀이 길어져서 2~3달 정도 냉장 보관된 채로 뒀는데 혹시 사용해도 이상 없을까요? 그냥 media면 당근 쓸 거같은데 collagenase와 DNase를 넣은 media라... 혹시 이런 경우 오랫동안 냉장보관하면 사용이 어려울까 싶어 질문드립니다.....

2023.09.27

Q

안녕하세요 Tet+배지에 균을 streaking해서 14 h 정도 37도씨에서 배양했는데요 오늘 plate를 꺼내서 확인하니 큰 colony들 옆에 짜잘짜잘한 colony(좁쌀같은)들이 생겼는데, 이것들은 모두 위성 콜로니로 보면 될까요? 균을 더 배양 안하는게 낫겠죠?

2023.09.27

Q

안녕하세요 cc필름에 액체로 된 음료, 물등을 접종시킬 때 배지 중간부분에 잘 떨어뜨리고 배지부분에서 잘 벗어나지 않게 정확히1ml만 따는데도 48시간 후 결과를 보면 어째서인지 옆면에 배지로 추정되는 액들이 묻어나옵니다. 겹치지 않을때도 저런 현상이 발생하는데 왜그러는건가요?

2023.09.27

Q

안녕하세요 western 실험을 한달동안 하고 있는데 해결되지 않는 문제가 있어서 질문 올립니다. 도와주시면 감사하겠습니다 마우스 지방 조직에서 beta actin 양을 보고 있습니다 그림에서 같이 위에 두꺼운 라인이 48kda 라인으로 예상되는 beta actin이 있는 라인입니다. 근데 항상 beta actin을 찍으면 아래에 선명한 또 다른 줄이 생기는데 이거는 무엇인지 알 수 있을까요? 답변 달아주시면 정말 감사하겠습니다

2023.09.27

Q

target RNA 발현량을 보고자 cDNA합성을 하고 qRT PCR 진행하려고 합니다. 다름이 아니라 cDNA는 single strand인데 qPCR 진행하고자 할때 primer forward, reverse 다 넣나요? 합성된 cDNA는 3'-5' 방향일텐데 먼저 reverse primer를 이용해 증폭시킨 후 dsDNA가 되면 일반 pcr 같이 넣어준 forward primer도 붙어 계속 증폭이 되는 시스템인가요?

2023.09.27

Q

매우 기본적인 질문입니다. 학교나 회사 연구실에서 마우스 행동실험을 하는데 보통 실험실 불을 켜고 하나요? 학생 때 동물 행동실험하는 경우 전등을 끄고 특정 조명을 켜서 실험 부위를 부추고 Y maze나 NOR test를 했던 것으로 기억합니다. 다른 분들은 어떻게 하시나요? 답변 부탁드립니다.

2023.09.27