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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 sequencing 고수님들..
뒷다리arimari(대학생)  |  04.21 11:59

sequencing 이 전혀 되질 않아 질문드려요 
PCR Product size은 약 500bp 이고 cDNA 에서 PCR을 떠서 direct sequencing 분석 중입니다.
PCR에 사용한 F/R 그대로 (sequencing 시에는 2pmol)사용하는데요
sequencing이 전혀 되질 않습니다. 
negative control cDNA에서는 band도 안나왔고 size도 맞는데
primer도 동일한데 sequencing 이 안되는 것은 무슨 이유일까요?
아예 지저분해서 읽을 수가 없어요 ㅜㅜ
primer도 2번 바꿔봤고 taq도 종류별로 다 써봤는데
band는 뜨는데 sequencing이 안되는 증상이 똑같아요

비슷한 실험 몇 번 했는데 대부분 PCR 단계가 문제있었고 이런경우는 처음이라
sequencing 조건을 어떻게 바꿔서 실험을해야하는지 노하우가 없습니다.ㅠㅠ

다른 sample들과 함께 진행하고 있고 다른 것은 잘 나오는 것으로 봐서 정제나 enzyme 문제 같아 보이지 않아서요

지금 조건은 abi bigdye쓰고 있고요

96도 1min
-
96도 10sec
50도 10sec
60도 3min  (25cyle)
-
10도 holding  조건으로 하고 있어요

조언 부탁드려요 ㅠㅠ


#direct sequencing
#sequencing
#pcr
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
sequencing peak가 그런데로 높은데, 여러 peak가 혼재해서 읽을 수가 없는 건가요?
만일 그렇다면, PCR product 가 균일하지 않다고 생각됩니다. size가 비슷한 다른 서열이 증폭되어 섞여 있다고 생각됩니다.
우선 사용한 primer 서열의 특이성을 BlastN 분석으로 재확인해 보세요.
primer 서열의 특이성이 문제가 없다면, cloning한 후 plasmid를 뽑아서 sequencing하는 것도 한가지 방법일 듯 싶습니다.


지나가다  |  04.21 15:42   
증폭된 dna fragment 의 50bp 안쪽 에 primer를 디자인해서 seq을 하면 안정적으로 잘 됩니다 제일 바깥쪽에 붙는 primer는 잘 워킹을 안합니다 그리고 pcr clean up을 꼭 하셔서 농축시켜서 일정량이상의 template 를 사용하셔야 합니다
앞다리Vinejung  |  04.21 19:21  
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