[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
BRIC을 시작페이지로 회원가입    로그인
BRIC실험
   
통합검색
배너1 배너2 배너3 스폰서배너광고 안내
오늘의 BRIC정보
모바일 BRIC RSS
트위터 페이스북
검색 뉴스레터 안내
좋은 연구문화 만들기
Bio일정
Bio일정
 
Bio일정 프리미엄(유료) 등록이란?
2017년 한국분자세포생물학회 정기학술대회 - 55건 등록
실험
실험
바이오 형광사진
실험의 달인들
Bio마켓
Bio마켓
BioJob
BioJob
Biojob 프리미엄(유료) 등록이란?
커뮤니티
커뮤니티
전체메뉴
대메뉴안내: 실험
실험 QnA 안전점검 논문교환
 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
조회 648  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 sequencing 고수님들..
뒷다리arimari(대학생)  |  04.21 11:59

sequencing 이 전혀 되질 않아 질문드려요 
PCR Product size은 약 500bp 이고 cDNA 에서 PCR을 떠서 direct sequencing 분석 중입니다.
PCR에 사용한 F/R 그대로 (sequencing 시에는 2pmol)사용하는데요
sequencing이 전혀 되질 않습니다. 
negative control cDNA에서는 band도 안나왔고 size도 맞는데
primer도 동일한데 sequencing 이 안되는 것은 무슨 이유일까요?
아예 지저분해서 읽을 수가 없어요 ㅜㅜ
primer도 2번 바꿔봤고 taq도 종류별로 다 써봤는데
band는 뜨는데 sequencing이 안되는 증상이 똑같아요

비슷한 실험 몇 번 했는데 대부분 PCR 단계가 문제있었고 이런경우는 처음이라
sequencing 조건을 어떻게 바꿔서 실험을해야하는지 노하우가 없습니다.ㅠㅠ

다른 sample들과 함께 진행하고 있고 다른 것은 잘 나오는 것으로 봐서 정제나 enzyme 문제 같아 보이지 않아서요

지금 조건은 abi bigdye쓰고 있고요

96도 1min
-
96도 10sec
50도 10sec
60도 3min  (25cyle)
-
10도 holding  조건으로 하고 있어요

조언 부탁드려요 ㅠㅠ


#direct sequencing
#sequencing
#pcr
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
sequencing peak가 그런데로 높은데, 여러 peak가 혼재해서 읽을 수가 없는 건가요?
만일 그렇다면, PCR product 가 균일하지 않다고 생각됩니다. size가 비슷한 다른 서열이 증폭되어 섞여 있다고 생각됩니다.
우선 사용한 primer 서열의 특이성을 BlastN 분석으로 재확인해 보세요.
primer 서열의 특이성이 문제가 없다면, cloning한 후 plasmid를 뽑아서 sequencing하는 것도 한가지 방법일 듯 싶습니다.


지나가다  |  04.21 15:42   
증폭된 dna fragment 의 50bp 안쪽 에 primer를 디자인해서 seq을 하면 안정적으로 잘 됩니다 제일 바깥쪽에 붙는 primer는 잘 워킹을 안합니다 그리고 pcr clean up을 꼭 하셔서 농축시켜서 일정량이상의 template 를 사용하셔야 합니다
앞다리Vinejung  |  04.21 19:21  
답변하기
할인행사 광고 검색광고
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
필코리아테크놀로지가 BRIC 기업기술웨비나에서 nanoString nCounter System를 소개합니다 (11.10까지)
부강테크 부강테크
분리/정제/농축 기술의 새로운 표준 "FMX" BRIC 우수제품 인증기념 할인행사 (11.19까지)
최근등록   더보기 >
GFAP, NeuN stainning   10.20
몰농도 계산 이게 맞나요 ? ㅠㅠ   10.19
선택배지에서 장내세균을 분리해서 DNA 추출했는데, 260/230 ratio가 너무 낮게 나옵니다.   10.19
물성기계 고장 관련 조언 부탁드립니다.   10.19
Clostridium sp. streaking plate 보관법 질문있습니다.   10.19
단쇄지방산을 GC로 분석하려합니다....   10.19
SARSTEDT 리튬 헤파린이 들어있는 튜브(41.1393.105) 급히 구매할 수 있는 곳 있을까요?   10.19
Luciferase 측정 장비   10.19
트리판블루   10.19
mg 132 처리실험관련   10.18
경희대학교 동서의학대학원
경희대학교 동서의학대학원 스폰서배너광고 안내
ZEUS
이전페이지로 돌아가기 맨위로 가기
 

BRIC 홈    BRIC 소개    회원    검색    문의/FAQ    광고    후원
Copyright © BRIC. All rights reserved. Contact member@ibric.org