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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 Western blotting 시, sample 조성 질문입니다.
알MC월아(과기인)  |  04.21 10:24
 안녕하세요. Western blot을 터득하고 있는 한 연구원입니다.


약 1달 째, 마우스 뇌 sample을 이용해서 pilot study를 수행하고 있는데, 밴드가 잘 나오지 않네요.


제가 실험을 수행했을 시에 보이는 문제점이 크게 2가지가 있는 것 같습니다.

1. Running 시, sample이 퍼져서 곡선을 이루거나 기울어짐.
2. ECL 용액을 사용하여 측정 시, 밴드가 거의 보이지 않음.

매 실험마다 문제점을 보완하고 보완하여 수행하는데 자꾸 반복되네요

그래서 질문이 있습니다.

1. Sample 조제 시, 각 농도에 맞게 sample, loading buffer와 함께 남은 용량을 RIPA buffer를 사용하는게 좋은가요 아니면 D.W.를 사용하는게 결과가 좋게 나오나요? 며칠 전에 저는 RIPA buffer를 사용했고, 다른 연구원은 D.W.를 사용하여 동시에 실험을 수행하였는데 제 것만 sample이 번졌고, 또한 밴드도 나오지 않았네요...

2. Running buffer, transfer buffer, TBST, 5% skim milk, ECL solution 등 western blot에 사용되는 시약을 냉장으로 보관한 상태에서 차갑게 사용하는데 상온에 두었다 사용해야할 제품이 있나요?

숙련자분들께서 문제점을 지적해주시면 감사하겠습니다.
#Western blot
#sample
#D.W.
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
1. 샘플이 running하는 동안 퍼져서 곡선을 이루거나 기울어지는 것은 running의 문제입니다.
upper buffer가 아래로 조금씩 새면 upper buffer가 부족해서 그런일이 발생합니다.
running하는 동안 딴데 가지 마시고 가끔 보세요.
upper buffer가 새는 것 같으면 보충해주세요.
그러면 해결될겁니다.


2. ECL이 안되는 것은 여러가지 문제가 있을 수 있습니다.
암실에서 e-tube에 ECL시약(과산화수소와 루미놀?) 을 5ul 씩 넣어서 형광이 나오는지 확인하세요.
만일 형광이 안나오면시약의 문제이므로 새 시약을 사용하세요.


3. 젤에서 멤브레인으로 단백질 transfer한 후에 ponseau-S로 염색해 보세요.
밴드가 안보이면 transfer가 안된겁니다.


4. 샘플 준비할때 부족분을 DW로 쓰던 RIPA를 쓰던 크게 상관은 없습니다.
하지만 보통은 샘플을 녹인 bufer를 사용합니다.


5. buffer는 상온이든 냉각상태든 큰 영향은 없습니다.

대왕개구리강시  |  04.21 11:04  
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