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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 765  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 western bloting 에서 궁금 한게 있습니다.
앞다리genom(대학원생)  |  03.20 17:53
안녕하세요. 저희방에서는 주로 동물세포의 단백질을 추출해서 western bloting으로 단백질의 증감을 많이 보는 랩실 입니다.
western bloting을 많이 해봤다라고는 말을 할수 없지만 이게 주인 방이라서 주로 이것만 하고 있는데 가끔 실험을 하다가보면 의문이 들때가 있습니다.

예를 들면 물론 저의 실수혹은 무지로 인해 나오는 결과 일수도 있지만 
같은 샘플에서 여러반복의 샘플을 하나에 SDS에 내렸을때 정량을 위해 디택션한 actin에는 각 반복마다 큰 차이가 없다고 생각이 되는데 target 단백질의 패턴이 가끔 다를 때가 있습니다.
예를 들면 chemical을 농도별로 투여해서  단백질의 증감을 볼때 반복마다 차이가 있을때가 있습니다.
항상 이런일이 발생하는건 아닌데 이유를 모르게 이러한 현상이 나올때가 있어서.. 의문이 듭니다.

sample에서 actin만 정확히 로딩하고 target 단백질만 날려먹기는 힘들다고는 생각이 드는데.. 왜 이러한 현상이  발생할까요? 초반에는 기포를 제대로 제거하지않아서 그부분이 더 감소한거 처럼 보이나 이런생각도 들었는데 지금와서 생각해보면 그문제는 아닌것 같습니다.

혹시 트랜스퍼시에 키트에 문제가 있어서 특정부분(well) 만 단백질이 덜넘어갈수가 있을까요?
아니면 그부분만 스펀지등이 허술해서 좀떠있어서 단백질이 제대로 안넘어 간것일까요?
혼자 고민도 해보고 선배에게도 물어봤지만 선배도 가끔 그럴떄가 있다고하는데 명쾌한 해답은 얻기가 어려웠습니다. 혹시 이것이 문제인것같다 라고 생각이 되시면 답변 부탁 드리겠습니다.


두서가 너무 길었습니다. 정리하자면 westernbloting시 같은 샘플로 반복한 샘플들을 한개에 젤에 내렸을때 2반복이 다르다면(actin등 정량은 일정하다고 가정시) 이유가 무었일까요?

p.s 추가로 예전에 western bloting관련 글을 보다가 다른분들이 남겨주신 tip중에 이해가 안되는 부분이 있습니다. sample dye까지 넣어준 로딩샘플을 heating한후에 cooling을 꼭하라고 하시던데 cooling이 필요한 이유가 무었일까요?
보통저희방 기준으로는 heating후 spindown해서 바로바로 내려주는데 저는 그글을 읽고나서 혹시몰라서 얼음에 잠깐씩은 박아준후 내려주고는 있습니다. 구글링도 해보고 해봤는데 이유는 잘 찾지못해서 답변 부탁드립니다.
하시는 실험 잘되시길 기원합니다~.
#western blot
#detection
#cooling
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
Boiling 후 cooling할 필요 없습니다. 그냥 quick-spin 후 로딩하면 됩니다.

본론의 이야기는 사실 웨스턴을 통해 타겟 단백질의 증감을 측정하는 대부분의 연구자들이 가지고 있는 고민일 것입니다. 그만큼 웨스턴이 정확한 실험 방법은 아니라는 이야기이지요. 이를 극복하기 위해서는 반복 실험을 통해 n을 충분히 늘려주어야 합니다.

실험 세트마다 결과가 조금씩 다른 이유는 여러 가지가 있겠지요. 하지만 개인적으로는 transfer 등의 문제라기 보단 약물 처리 단계나 sample prep에서 variability가 나타날 것이라 생각되네요.
청개구리Lucid  |  03.20 22:44  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
  저도 actin 같은 샘플이 매번 달라서 원인 잡느라 고생한적이 있었는데
이것저것 다 바꿔보다가 결국 찾아낸것이 익스포즈였습니다.
아마 익스포즈 하시고 다르다면 다시 그위에 ECL을 재처리하여서 찍어보세요. 제대로 나올수도 있습니다. 그래도 이상하다하면 한번 워싱후에 다시 ECL 재처리 해보세요~


간혹 워싱문제일수도있구요 
청개구리상후니  |  03.21 19:28  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
값이 잘 나오지 않으면 n수를 늘려 평균값을 찾고, 실험 프로토콜을 조정해보셔야 할 듯 합니다...
청개구리LAB.pi  |  03.22 14:03  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
membrane 전체에 target protein의 antibody을 붙여보세요. Sample을 만드는 과정에서 문제가 생겨 band가 나뉘는 경우도 있었습니다.
알만만디  |  03.27 20:43  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
 모든 분들이 너무 성심껏 답변해 주셔서 제가 굳이 달 이유는 없다고 판단됐으나 몇 가지 알려드리고 싶은 것이 있어서 답변합니다.
 우선 WB을 많이 안해보셨다고 하시는데, actin도 loading 양을 적게 해서 expose 시간을 짧게 하여 보신다면 차이가 있을 것입니다. 그리고 그 차이를 명확히 확인하고 싶으시면 단백질마다 serial dilution하여 standard를 걸어보세요. 단백질마다 그 intensity의 변화가 확연히 차이날 것입니다.
 때문에 어떤 단백질은 1/4로 dilution해도 거의 차이가 나지 않는 것도 있습니다. 만약 standard가 없다면 별 차이 없다고 느낄 수 있을 정도로 말이죠.
정리하자면, 그 차이를 느끼고 싶으시면 standard를 거시고 loading양을 줄여서 확인해 보세요.
그리고 마지막으로 heating후 cooling하는 것은 단백질이 renaturation될 수 확률을 더욱 확실히 없애주기 위함이죠. 또한, 그렇게 팔팔 끊는 sample을 loading하지는 않기 때문입니다. 큰 이유는 없어요.
안암로터리  |  03.29 16:24   
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