[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 동향
시스템점검 12월 13일 오후 10시
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
전체보기 뉴스 Bio통신원 Bio통계 BRIC이만난사람들 웹진(BioWave)
BRIC View
최신자료 동향리포트 학회참관기 리뷰논문요약 BRIC리포트 외부보고서
RNA 치료제에 대한 세포 장벽 극복
RNA 치료제에 대한 세포 장벽 극복 저자 김윤혜 (The Hospital for Sick Children)
등록일 2018.10.23
자료번호 BRIC VIEW 2018-R24
조회 1743  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
Small-interfering RNAs (siRNAs), microRNAs (miRNAs), antisense oligonucleotides (ASOs), aptamers, 합성 mRNAs 및 CRISPR-Cas9와 같이 RNA를 기반하는 치료제들은 현재 약물을 통해서 조절 할 수 없는 많은 유전자 및 유전자 산물 들을 표적하고, 암에서부터 유행성 인플루엔자, 알츠하이머에 이르는 질병들에서 새로운 치료 패러다임을 창출할 수 있는 중대한 잠재력이 있다. 그러나 이러한 RNA의 잠재력이 최대한으로 발휘되려면 먼저 세포 외부의 RNA를 세포 내부로 침투하지 못하게 하는 오랜 시간 동안 진화적으로 완성된 방어체계를 극복해야 한다. 지질 이중층을 뚫고 RNA를 세포로 전달하는 것이RNA 치료제의 광범위한 개발을 위한 주요 과제로 남아 있으나, 최근의 화학적 기술의 발달로 인해 이 진화적 갑옷을 뚫어 내기 시작했다.
키워드: RNA 치료제, RNAi (RNA간섭), 약물 전달
분야: Biotechnology
본 자료는 Overcoming cellular barriers for RNA therapeutics. Nature Biotechnology, 35 (3), pp. 222-229.의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목차

1. 본 내용
2. 단일 가닥 ASO의 전달
3. 이중 가닥 siRNA의 전달
4. 엔도좀 탈출
5. 결론


1. 본 내용

지난 10년간 표적 RNA나 DNA에 대한 높은 선택적 특이성으로 인해, RNA 기반 치료법은 학계와 산업으로부터 많은 관심이 집중되었다. 이 약물들은 약물 적용이 되지 않는 인간 및 바이러스 유전자의 발현 억제, mRNA의 splicing 조절, 후성유전 조절에 관여하는 비암호화 RNAs (ncRNA) 표적, 표적 유전자의 증가, 유전자의 발현 그리고 유전체 교정 등의 작업을 선택적으로 가능하도록 해준다. 이러한 부분들은 저분자 억제제나 항체를 통해 실현될 수 없었던 형태의 치료적인 작용이다. 또한 RNA 기반 치료법은 암 돌연변이 및 전염병 바이러스 감염과 속도를 맞출 수 있는 발전 능력을 가진 유일한 방법이다. 2세대 RNA 화학 기술들은 RNA 치료제의 안정성을 크게 향상시키고, 의도하지 않은 부작용을 감소 시키며, 표적을 향한 약리 활성을 최대화 시킨다. 이러한 새로운 화학 기술들은 10여년 전에 저조한 성능을 보이던 RNA들을 이제는 거의 준비가 된 미래에 필수적인 치료제로 전환시켰다.

그러나 RNA 기반 치료법의 잠재력을 둘러싼 열광적인 기대에 반해 오래 전부터 제기되어왔던 약물 전달 문제는 지속적으로 지적되고 있다. 생명체는 원시 RNA와 고분자 용액들이 지질 이중층에 의해 캡슐화되어 외부의 RNA와 거대 분자들의 간섭 없이 독자적인 화학 반응이 가능해짐에 따라 발생되었다. 지질 이중층은 1,000 Daltons (Da)보다 작은 중성, 약간의 소수성 분자 <1,000 Daltons (Da)의 수동적 확산을 허용하는 반면, RNA와 같은 큰 분자의 이동은 제한한다. 따라서, 지질 이중층은 생명을 창조하고, 침입하는 RNA로부터 방어하는데 있어서 기본적인 것이었다. 이 오래된 장벽 위에는 RNases와 선천적인 면역 패턴 인식 Toll-like receptors (TLRs) 3, 7, 8, 이중나선 RNA 수용체 PKR 등을 포함하여, 침입하는 RNA로부터 metazoan 세포를 더욱 보호하기 위해 고안된 일련의 진화적 방어 장치가 있다. 또한, RNA는 신장과 간세포의 포획 수용체에 의해 혈액으로부터 빠르게 제거된다. 결과적으로, RNA 기반 치료제를 성공적으로 전달하기 위해서는 수십억 년에 걸쳐 완성된 진화적 방어 체계를 무너뜨리는 것이 필요하다. 이러한 장벽들 중에서도 지질 이중층을 통한 전달은 해결해야 할 '문제'로 남아 있다. 저분자 억제제는 분자량이 적고, 낮은 전하량 및 충분한 소수성 성질을 통해 세포막의 지질 이중층을 부드럽게 미끄러져 넘어갈 수 있다. 이와 대조적으로, 모든 RNA 기반 치료제는 지질 이중층을 가로 지를 수 있는 능력이 없으며 크기가 크고 고전하량의 거대분자 물질이다 (그림 1).

RNA 기반 치료제는 세포막 포집 현상(endocytosis)에 의해 흡수될 수 있는 거대 분자이지만, 그 이후에 엔도좀(endosome) 내부에 갇힌 채로 남아있어 세포질과 핵 밖에 존재한다. 클라쓰린, 카베올레, 식세포작용, 대음세포작용 등 여러 가지 세포막 포집 현상이 있지만, 지질 이중층을 가로 지르는 문제는 모든 형태의 세포막 포집현상에서 동일하게 발생한다. 따라서 RNA 기반 치료제를 엔도좀에서 세포질 내로 독성없이 전달하는 것이 RNA 기반 치료제의 잠재력을 최대한 활용하기 전에 해결해야 할 핵심 기술 과제이다.

upload image
그림 1. RNA의 침입을 막는 40억년된 지질 이중층 보호막.



2. 단일 가닥 ASO의 전달

단일 가닥 ASO 분야는 1978년 Paul Zamecnik의 연구실에서 phosphodiester 골격을 가지는 ASO의 합성으로 시작되었다. 불행히도, phosphodiester 결합은 높은 전하를 가지며 친수성이고 핵산 분해효소에 의해 쉽게 분화된다. 다행히도 1966년 Fritz Eckstein에 의해 진행된, 인산염 그룹 중 하나의 산소가 황 원자로 치환 된 모노뉴클레오타이드 (phosphorothioate) (그림 2)의 변형에 대한 연구 결과는 인산디에스터 분해효소(phosphodiesterases)에 대한 저항성을 크게 증가시키고 소수성을 증가시켰다. 1984년에 Stec, Zon 및 Egan은 최초의 완전 phosphorothioate ASO를 합성하여 안정성과 전달 가능성을 극적으로 향상 시켰다. 또한 phosphorothioate ASO는 전달 단백질 역할을 하는 알부민과 같은 혈청 단백질에 열성적으로 결합하여 ASO 약물 동태학적(PK) 특성뿐만 아니라 세포 내 단백질과의 결합을 크게 증가시켰다. 따라서, oligonucleotide에 phos-phorothiate 화합물을 혼합시키는 것이 ASO 영역에서 얼마나 중요한지를 알 수 있다. phos-phorothioates는 중심부라 chiral 형태이기 때문에, 21염기 ASO는 실제로 106 입체 이성질체의 혼합물이다. Stec 등은 효능을 높이기 위해 ASO 기능에 대한 phosphorothioate 입체이성질체의 양상을 조사했다. 이러한 연구는 Wada 그룹에 의해 진행된 입체 특이적 phosphorothioate ASO의 합성으로 이어진다. 그러나 다른 연구자들은 phosphorothioate ASO 이성질체의 혼합물이 최적의 활성을 유지한다고 보고하였으며, 이는 추가 연구가 필요한 영역으로 남아있다.

ASO의 효능 및 약리학적 특성을 향상시키기 위해서는 2'- hydroxyl (OH)를 화학적으로 변형시키는 방법이 있다. 이는 표적 mRNA에 대한 결합 친화성을 증가시키고, 이에 따라 ASO의 전체 길이를 감소시킨다. 종합적으로, 이러한 화학적 변형은 ASO 안정성을 더욱 향상시키고, 표적 RNA에 대한 결합력을 결합시키고, ASO 길이를 감소시킴으로써 전달을 도울 수 있다. 오늘날에 전임상 혹은 임상 실험 중에 있는 ASO들은 광범위한 2 '변형을 가진 phosphorothioate 골격을 가지고 있다.

다른 거대분자 치료제와 마찬가지로, 비접합된 그 자체의 ASO는 세포막 포집 현상에 의해 세포 내로 흡수된다. 그러나, phosphorothioate 골격의 증가된 소수성으로 인해 엔도좀 지질 이중층 장벽을 통과하여 탈출 할 능력이 없는 이중 나선 siRNA와는 달리, ASO는 엔도좀 지질 이중층을 통과하여 아직 알려지지 않은 기전을 통해 세포질과 핵으로 빠져나간다. 이러한 실질적인 이점으로 인해 간과 중추신경계(CNS)를 표적으로 하는 ASO를 대상으로 한 수많은 임상 시험이 진행되었다.

간의 특징인 직접적인 혈액 접근성 및 빠른 세포막 포집 현상과 같은 여러 이유들로 인해 간세포는 ASO를 잘 받아들인다. 그러나 ASO의 간세포 전달을 향상시키기 위해 Seth, Henry 및 공동 연구자들은 tris N-galactosamine (GalNAc) 표적 도메인을 ASO에 접합시켜 ASO의 활성이 10배 향상된 것을 관찰하였다. GalNAc 표적 도메인은 1990년대 말에 Erik Biessen 연구실에서 개발되었으며, 간세포에 매우 풍부한 trimeric asialoglycoprotein 수용체(ASGPRs)에 결합한다. 이러한 관찰은 2세대 ASO 화합물의 개선을 기반으로 하며, 표적 도메인에 결합된 ASO 치료제의 잠재성을 보여준다.

upload image
그림 2. 엔도좀 탈출의 확률.



ASO는 혈액 뇌 장벽(BBB)을 통과할 수 없다. 그러나 스미스(Smith) 등은 척수강을 통한 뇌척수액(CSF)으로의 ASO 투여가 뇌 실질조직 전반에 걸쳐 광범위하게 약물이 분포되도록 하여 뉴런 및 다른 세포 유형에 흡수되고, 엔도좀을 벗어나서 세포 내로 들어감을 확인하였다. 현재 여러 신경질환(HD, ALS 및 SMA)에 대해 진행중인 상업용 중추신경 임상 실험 프로그램이 3개 있다. 미국 FDA는 최근 SMA에 대한 Biogen/Ionis'nusinersen (Spinraza), splice-switching oligonu-cleotide (SSO)를 승인하였으며, 이 약은 유럽 의약청의 결정을 기다리는 중에 있다. 이러한 임상적 성공은 ASO의 CNS 적용에 고무적이지만, 이 약물의 전달 기전은 뇌척수염에서 뇌 실질 조직으로 넘어가는 것으로 완전히 알려지지 않은 상태이다. 따라서 ASO 흡수 기전을 밝히기 위한 더 많은 노력은 중추신경에 대한 phosphorothioate ASO의 적용을 향상시키는 더 큰 기회를 이끌어 낼 수 있다.

두 가지 대안적인 안티센스 화학물 접근법은 전하가 걸린 phosphate 결합과 리보오스 당 골격을 중성 phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO) 또는 peptide nucleic acid (PNA) 골격으로 대체하여 올바른 핵 염기 간격을 유지하는 것이다 (그림 2). 그 결과로 표적 mRNA에 선택적이고 강하게 결합하는 고도로 안정화된 분자가 된다. 그러나 PMOs와 PNAs는 phosphodiester 골격이 없기 때문에 RNase-H (유전자 억제에 필요함)를 활성화 시킬 수 없으며, 대신에 입체 차단제(Steric blocker)와 엑손 건너뛰기를 위한 SSO로 사용될 수 있다. 몇몇 그룹에서는 Duchenne 근이영양증(DMD)의 생쥐 모델에서 splicing을 건너뛰거나 교정하는 용도로 PMO와 PNA를 사용하여, 부분적으로 기능하는 디스트로핀 단백질을 발현하게 하여 질병을 개선시킨다. DMD에서는 디스트로핀이 없기 때문에, 근육 세포막이 매우 불안정하고 투과적으로 되어서 전달 수준을 높일 수 있다. 이것은 표적 근육 세포로의 PMO의 전달이 질병 상태 그 자체에 의해 크게 촉진되는 특별한 예이다. 강력한 전임상 결과에 근거하여 Sarepta Therapeutics (Cambridge, MA, USA)는 DMD 치료를 위해 PMO인 eteplirsen (Exondys)를 개발하였다. DMD 환자의 제한된 집단 연구 결과에서는 디스트로핀 발현이 소량 증가하는 등 전임상 결과에 비해 훨씬 덜 탁월했지만, 그럼에도 불구하고 FDA는 eteplirsen 조건부 승인을 부여하기로 결정했다.

종합적으로, 현재까지의 ASO 전달의 성공은 현재 당면한 과제들을 효과적으로 극복하는 새로운 올리고 뉴클레오티드 화합물뿐만 아니라 ASO의 약물동태학적 특성과 병이 있는 조직의 특이성을 이용하는 것에 대한 결과물이다. 그러나 대부분의 조직 및 세포 유형들은 현재의 ASO 전달 방법을 통해서는 전달될 수가 없다. GalNAc 접합체의 극적인 성공은 phosphorothioate ASO 영역을 세포 유형 특이적인 표적 도메인의 방향으로 이끌고 있다.

3. 이중 가닥 siRNA의 전달

포유류에서 이중 나선 short-interfering RNA (siRNA)에 의해 유도되는 RNAi 반응 분야는 worm 모델에서 1998년에 RNAi를 발견하여 노벨상을 수상한 Fire와 Mello의 연구에 뒤 이은 Tuschi 그룹의 연구에 의해 2001년에 떠들썩 하게 나타났다. 그들은 mRNA에 직접적으로 결합할 수 있으며, 이질적인 화학적 변형이 가해질 수 있는 ASOs와는 달리, siRNA는TAR (Trans-Activation Response) RNA 결합 단백질(TRBP)이 촉매 작용을 나타내는 부분인 Argonaute (Ago2)에 삽입 될 때까지 비활성 상태이다. Ago2에 삽입된 후, sense 또는 passenger 가닥은 제거되고 anti-sense 또는 guide 가닥은 유지된다. Ago2는 중간 영역의 강한 결합과 전하 인산 골격에 대한 다수의 접합 및 center groove 아래의 2'-OH에 의해 guide 가닥의 5 '말단을 결합시키고, 3'말단 수산기에 결합하는 PAZ 도메인을 결합시킨다. 결과적으로, 모든 siRNA 화학적 변형은 이중 가닥 A형 RNA 구조를 유지하거나 모방해야 한다. 당연히 세포 내 효소에 대한 이러한 의존성 덕분에 siRNA 화학 변형의 종류와 범위가 심각하게 제한된다. 다행히도, 2'-F와 2'-O-Me 변형 (그림 2)은 2'-OH의 생물 물리학적 성질을 가깝게 모방하고 RNAi 작동 기전에 의해 허용되며, siRNA를 안정화시키고 선천성 면역 수용체(TLR, RIG-I, MDA-5)의 활성화를 방지한다. 실제로 오늘날에 시도되는 siRNA 임상 시험들의 대부분은 2'-F/O-Me 변형을 포함하고 있다.

활성을 유지하면서 siRNA의 전체 전하를 줄이는 것은 siRNA 전달 성과 안정성을 향상시키는 데 중요하다. Alnylam사의 Segal은 siRNA 가닥의 말단에 phosphorothioate를 결합시켰다. 이러한 유형의 직접적인 화학 변형은 in vivo에서의 RNAi 반응의 안정성, 효력 및 지속 기간을 크게 향상시켰다. 마찬가지로, TRBP가 siRNA에 결합하는 기전을 이용하여, 몇몇 연구 그룹은 5' 말단의 뉴클레오타이드를 제거하고 연장된 3' 단일 가닥의 guide 가닥 꼬리에 phosphorothioates를 위치시킴으로써 passenger 가닥의 길이를 감소시켰다. 이는 결과적으로 전달을 돕기 위해 지질 이중층에 내장된 스테롤에 접합되었을 때 전체 전하를 감소시키고 약물 전달을 증가시킨다.

Phosphorothioate 이후에도, siRNA의 하전된 phosphodiester 결합은 화학적 조작에 완강하게 버텨왔다. 본 연구진은 중성의 생체 내 가역적인 phosphotriester oligonucleotides의 합성 화합물을 연구하여 siRNA의 전체 전하를 줄이기 위한 대안적인 접근법을 사용했다. 이러한 시험물은 short-interfering rebinucleic neutral (siRNN) 분자라고 명명되었다. 그것들은 약물을 전달하기 위해 약물의 음전하를 숨기고 siRNN 표면을 분자적으로 변형시켜 단백질 표면을 모방하는 방식의 트로이 목마 접근법을 나타낸다 (그림 2). 세포 내부에서는, 세포질 효소들이 phosphotriester 결합을 절단하여, 신속하게 세포 내부에서 중성 siRNN을 본래의 음전하 phos-phodiester siRNA로 두 단계 전환을 개시하여 강력한 RNAi 반응을 일으킨다. 중요한 점은, 가능한 많은 효과를 내기 위하여 높은 약물 동태학적 특성이 요구되는 전신 질환을 치료하기 위해서는 신장에 의한 제거를 피하고, 간세포 수용체 흡수를 방지하기 위해서 기본 골격의 phosphotriester 중화가 필수적이며, RNase에 의한 인식을 피해서 안정성을 증가시켜야 한다. 차세대 RNA 화학 물질의 개발은 세포의 RNAi 효소 기전에 적합해야 하는 상황 내에서 작동하여 지난 10년 동안 siRNA 약물과 같은 특성을 크게 향상 시켰다.

화학적 변형은 안정성을 향상시키고 타고난 면역 반응을 감소 시키며 전반적인 전하량을 줄이는 데 중요하지만, siRNA는 지질 이중층을 가로 지르고 세포에 들어가기위한 생체 이용률이 없는 ~ 14 kDa 거대 분자이다. 결과적으로, ASO와는 달리 siRNA에는 전달 인자가 필요하다. 초기 siRNA 전달법으로는 본래 DNA 매개 유전자 치료를 위해 고안된 지질 나노 입자(LNP)와 합성 나노 입자를 채택하였다. 이 LNP는 이온성 지질을 사용하여 siRNA 전달을 위해 재구성되고 최적화되었으며, 간 표적 유전자에 대해 ~ 1 mg/kg에서 0.01 mg/kg까지 투여량을 100배 정도 효과적으로 낮추는 효과를 나타내었다. Alnylam은 현재 LNP siRNA 제형으로 간 transthyretin am-yloidosis (TTR) 치료를 위한 목표로 임상 3상 실험을 진행하고 있다.

그러나 LNP의 전달 능력을 향상시키기 위해서는 상당한 비용이 든다. 첫째, LNP 합성은 일반적으로 서로 다른 독성 특성을 갖는 4~5개의 성분을 다른 비율로 첨가해야 한다. 수용액 상태에서 그 크기를 유지하는 것도 어려움이 있다. 둘째, 단일 LNP가 잠재적으로 100개의 siRNA를 전달할 수 있지만, 직경 100 nm의 LNP는 크기가 ~ 100 MegaDa이거나 전달되는 14 kDa siRNA 약물보다 5,000배 더 크다. LNP 크기는 전달이나 약물동력성을 악화시키며, 따라서 간세포의 특이적인 Disse 구조 공간을 이용하여 주로 간을 표적으로 삼는다. 셋째, 종양학에서 고형 종양에 LNP를 통해서 siRNA를 전달하는 것은 종양에서 혈관이 충분히 붕괴되어 투과성 및 유지가 향상되어(Enhanced Permeability and Retention, EPR) 나노 입자의 종양 내 축적이 허용되는 것을 전제로 한다. EPR 효과가 빠른 속도로 성장하는 설치류 종양 모델에서 한 부분을 차지함에도 불구하고, 인간 종양에서는 EPR효과가 어느정도 발생하는지는 불분명하다. 종합하면, LNPs는 많은 siRNA 전달 장벽을 해결하지만, 정상적인 간 또는 국소 전달 이외의 용도로는 중대한 결점이 아직 남아 있다.

AlNylam의 Manoharan 그룹이 간세포를 대상으로 크게 단순화되고 상당히 작은 분자량의 대체 siRNA 전달 방법을 선보였으며, 이는 Tris-GalNAc 도메인을 고도로 안정화 된 siRNA에 직접 결합시키는 것이다. 위에서 언급한 바와 같이 GalNAc-siRNA 전달은 성공적으로 진행되어 Alnyl-am은 현재 간 유전자에 대한 7개의 GalNAc-siRNA 임상 프로그램을 보유하고 있으며, 이는 2세대 ESC RNA 안정화 기술을 활용하여 복용량과 독성에 대한 우려를 줄였다. 이 접근법을 활용하여 Arrowhead Pharmaceuticals (미국 캘리포니아 주 Pasadena), Dicerna Pharmaceuticals (Watertown, MA, USA) 및 Solstice Biologics를 포함한 여러 RNAi 개발사들이 약물을 개발하고 있다. 복합 LNP 제형과는 달리 GalNAc-siRNA 접합체는 고체 상태의 RNA 합성기에서 쉽게 합성 가능하며 질량 분광법을 통해 화학적으로 분석될 수 있다. siRNA의 간세포 전달을 최적화하기 위해, 삼량체 AS-GPR과 효율적으로 결합하기 위해서는 tris-GalNAc의 접합이 필요하다.

종합적으로, GalNAc-siRNA 접합체가 최선의 선택된 약물이 되는 시점에서, 이 성공은 RNAi 치료제가 대형 LNP에서 작고 표적화된 siRNA로 흐름이 바뀌었음을 명확히 보여준다.

4. 합성 mRNA 및 CRISPR-Cas9 유도 RNA의 전달

다양한 연구그룹들은 1990년부터 유전자 발현을 위해서, 최근에는 백신 개발을 위해 mRNA를 이용하기 위한 접근법을 개발해왔다. 유전자 변형의 우려가 있는 DNA 기반 유전자 치료법과는 달리, 합성 mRNA 기반 치료법은 일시적으로 치료 단백질을 발현하는 히트 앤 런 전략을 사용하며 그 이후에는 mRNA가 분해된다. 내재 면역 체계를 활성화시키지 않도록 여러 기법을 통해 개선하고는 있지만, 2kb에서 20kb의 크기를 가지는 자가 복제 RNA인 mRNA 치료제는 높은 전하량을 가지며 생체 이용률이 거의 없다. 그러나, 만성 질환의 mRNA 치료는 반복적인 LNP mRNA 투여가 필요하지만, LNP나 합성 NP와 관련된 독성이 아직 중요한 장벽으로 남아있다. 이와 대조적으로, 상대적으로 작은 부위의 세포에 작용해 강한 면역 자극 반응을 유발하는 근육 내 RNA 백신 전달의 경우 LNP 뿐만 아니라 양이온성 나노 에멀젼(Cationic Nano Emulsion)의 전기천공법과 같은 효과적인 전달 방법이 있다. 따라서 RNA 백신의 전달이 그 잠재성을 입증하는 동안, 치료용 단백질을 생산하기위한 mRNA를 전신 전달하는 것은 여전히 큰 제한이 있으며, 현재 간에서의 발현 만이 허용 되어있다. 2012년 CRISPR-Cas9 유전자 편집 방법이 세상에 발표되었을 때, 임상에서 CRISPR 구성 요소들을 인체로 전달하는 방법의 문제는 즉시 최우선 항목으로 떠올랐다. CRISPR 시스템이 자체적으로 제대로 작동하기 위해서는 두개의 거대 분자(Cas9 재조합효소, 단일 guide RNA sgRNA)가 필요로 하기 때문에 이러한 전달 문제점을 이중으로 가지고 있다.

전달 문제의 상위에는 윤리적 문제뿐만 아니라, 환자의 유전체 DNA가 변경될 때 인간 유전자 편집의 정확성 문제가 있다. 이로써 계속적인 Cas9 발현을 유발할 수 있는 DNA 기반 벡터를 인간에 사용하는 것을 배제하고 있다. 결론적으로, 초기 CRISPR의 임상 적용은 생체 밖 세포로의 CRISPR 성분 전달, 그리고 환자의 세포 교체로 초점을 맞출 것으로 보인다. 펜실베니아 대학(University of Pennsylvania)은 암 환자에게서 추출된 면역 T 세포에서 PD1 및 TCR a/b를 암호화하는 유전자를 생체 외에서 CRISPR를 통해 삭제한 후 환자에게 재주입하기 위해 NIH 재조합 자문위원회(RAC)의 허가를 신청했다. 그러나 CRISPR를 통한 임상 유전자 편집의 첫 번째 실험은 중국 쓰촨 대학의 Lu You 그룹이 페암 환자의 T 세포에서 PD1 유전자를 삭제 한 다음 환자에게 다시 주입하는 것으로 수행되었다. 하지만 CRISPR의 경우, 아직 개발이 진행중인 현재 단계에서 이러한 전달 접근법, 표적 세포 및 질병이 CRISPR를 통한 유전자 편집의 임상 적용 잠재성을 보여줄지 여부를 예측하는 것은 아직 이르다.

5. 엔도좀 탈출

RNA 기반 치료제를 세포에 전달하는 분야에서, 그 최종 종점에는 엔도좀 탈출이 자리하고 있다 (그림 2). 간으로의 ASO 및 siRNA 전달은 ASGPR 표적 GalNAc-siRNA 접합체에 의해 해결될 수 있고, LNP에 의한 mRNA 및 CRISPR 전달은 확실해 보이지만, 효과적이고 임상적으로 준비된 RNA 기반 치료제를 간 이외의 전신에 전달하기 위한 접근은 아직 최종 종점 단계에 머물러 있다. 정확한 이유는 알려져 있지 않지만, ASGPR은 거대 분자 약물이 간세포로 전달되는 데 매우 적합한 특성을 가지고 있다. 그 이름이 암시 하듯이, ASGPR은 혈중 asialoglycoproteins에 결합하여 그들을 clathrin-coated endosome으로 끌어 들여 분해를 위해 리소좀에 유입시킨다. ASGPR 결합된 asi-aloglycoproteins은 세포질로 빠져 나가는 것으로는 생각되지 않는다 (그림 2). 그러나 간세포는 수많은 ASGPR를 세포 표면에 발현하는데, 이것들은 매 10~15분의 속도로 놀랄만큼 빠르게 순환한다. 최대의 RNAi 반응을 위해서는 최소 5,000개의 siRNA가 필요하다. ASGPR의 GalNAc 결합은 아주 드물게 막의 불안정성을 유발하며, 이는 수백만의 siRNA 분자가 ASGPR 엔도좀으로 매 15분 마다 들어가고, 0.01%보다 낮은 탈출 효율을 가짐으로써, GalNAc 전달을 통해 하루 동안 5,000개가 넘는 분자를 전달할 수 있다.

불행히도, 이렇게 빠른 속도로 수용체를 발현 시키거나 엔도좀으로 빠르게 순환시킬 수 있는 다른 리간드-수용체 시스템은 존재하지 않는다. 사실, 대부분의 세포 표면 수용체는 10,000-100,000 범위(또는 그 이하)로 발현되며, 카베올린 및 클라트린 매개 세포막 포집은 일반적으로 90분 단위로 회전된다. 이론적으로, 수용체를 표적으로 하는 전달법은 매 2시간마다 세포의 엔도좀에 ~ 100,000개 이상의 siRNA를 가져올 수 있다. 그러나 엔도좀 탈출 효율이 0.01% 미만으로 추정되는 경우 최소 5,000개인 필요 임계점에 도달하기가 어렵게 된다. 현재 여러 연구 그룹이 엔도좀 탈출 문제에 대한 해결책을 연구하고 있다.

고전적인 접근법은 저분자성 엔도좀 분해 인자인 클로로퀸을 사용하는 것이다 (그림 3). 클로로퀸(chloroquine)은 세포막을 통해 수동적으로 확산하여 pH가 떨어지면 양성자가 되어 엔도좀 내부에 갇히게 되어 엔도좀 내 농도가 급격히 증가한다. 클로로퀸은 소수성 모티프를 지질 이중층에 삽입하고 일정 농도에서 엔도좀을 용해시킨다. 그러나 효과를 나타내는 농도에서 이러한 엔도좀 분해 인자들은 비 특이적으로 siRNA 화합물을 포함하는 엔도좀 뿐만 아니라 다른 세포 내 엔도좀을 용해시켜 독성을 일으킨다. 결과적으로, 이러한 저분자 엔도좀 분해 인자들은 개발 단계에서 주목을 받았지만, 현재 임상 용도로 쓰기에는 잠재적 독성 위험이 있다.

대안적인 엔도좀 탈출 접근법은 RNA에 직접적으로 엔도좀 분해성 펩타이드 또는 분자를 접합시켜 RNA 치료제를 함유하는 엔도좀에 대해 분해 작용을 제한시키는 방법이다. Arrowhead Pharmaceu-ticals는 two-molecule dynamic polyconjugate (DPC) 시스템을 개발하였다. siRNA는 콜레스테롤과 결합하여 혈액으로 큰 골재구조(저밀도 지단백질)를 형성하여 간으로 이동하여 간세포로 세포막 포집에 의해 흡수된다. 두 번째 분자는 막을 용해하는 구멍형성 멜리틴 펩타이드 (벌독에서 유래)의 유도체이다. Arrowhead는 pH 민감성으로 멜리틴을 합성하고 이를 GalNAc에 접합시켰다. 간세포 엔도좀의 낮은 pH에서 멜리틴은 활성화되고 엔도좀을 분해하여 siRNA를 세포질로 방출하도록 한다 (그림 3). 하지만, 멜리틴으로 인한 독성으로 인해 Arrowhead는 FDA와 진행하던 멜리틴에 의존하는 세 가지 임상 프로그램을 모두 중단하기로 결정했다. 이런 점은 엔도좀 탈출 문제를 해결하는 것이 어려운 과제임을 보여준다.

upload image
그림 3. 엔도좀 탈출을 위한 방법.



6. 결론

RNA 기반 치료법은 전통적인 저분자 물질 및 항체 치료법에 비해 세 가지 주요 이점을 제공한다. 첫째, 특정 세포 유형 또는 조직에 대한 전달 (예를 들어, 간세포에 대한 siRNA/ASO 전달, CNS에 대한 ASO 전달)이 개발되면, 상기 세포 유형의 모든 질병 촉진 유전자를 표적화 할 수 있는 가능성이 높다. 둘째, RNA 치료제는 단일 유전자를 선택적으로 표적화 할 수 있으며, off-target 유전자를 멀리 하도록 하기 위해 쉽게 조작 할 수 있지만, 소분자 억제제는 종종 비특이적으로 여러 표적을 공격하고 알려지지 않은 표적을 가지고 있다. 셋째, 표적이 고정 된 저분자 및 항체와는 달리 RNA 치료제는 암 또는 유행성 인플루엔자와 같은 질병과 동일한 속도로 약물을 개발 및 투여 할 수 있습니다. 이러한 특성 때문에 RNA 기반 치료제는 전달 방법만 해결이 된다면 치료가 불가능한 인간의 질병을 치료할 수 있는 상당한 가능성을 제공한다.

이제 ASO, RNAi 및 mRNA 화학 물질은 높은 목표 활성을 유지하면서 안정성을 유지하고, 내재 면역계를 회피할 수 있는 단계로 나아갔다. 이들 분자들이 특정 세포 유형이나 조직을 표적으로 하기 위한 더 많은 연구가 필요하며, 가장 중요하게는 비독성 엔도좀 탈출 물질을 개발하는 것이 중요하다.

RNAi 및 ASO에 대한 GalNAc 접근법은 표적 영역을 RNA 치료제에 접합시키는 방향으로 개발 방향을 이끌고 있다. 그러나 Endosomal escape은 모든 RNA 기반 치료법에 적용되는 문제 해결을 위한 핵심 문제로 남아 있다.

큰 그림을 보면, mRNA와 CRISPR의 치료 가능성과 함께 임상 시험에서 ASO, PMO 및 Gal-NAc-siRNA의 최근 성공은 우리가 RNA 기반 치료법의 새로운 시대의 문턱에 있다는 것뿐만 아니라, 간 이외의 조직으로의 전달이 해결된다면, 이 약물들은 미래의 치료 환경을 지배할 가능성이 있다는 것을 보여준다.

  추천 0
  
인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
  
본 게시물의 무단 복제 및 배포를 금하며, 일부 내용 인용시 출처를 밝혀야 합니다.
Citation 복사
김윤혜(2018). RNA 치료제에 대한 세포 장벽 극복. BRIC View 2018-R24. Available from http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3083 (Oct 23, 2018)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
  댓글 0
등록
목록
포스텍 I-BIO
위로가기
동향 홈  |  동향FAQ  |  동향 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북    RSS서비스 RSS
머크