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재조합 항체 단편을 이용한 암 면역치료(Recombinant antibody fragment-based cancer immunotherapy)
재조합 항체 단편을 이용한 암 면역치료(Recombinant antibody fragment-based cancer immunotherapy) 저자 정희진 (홍익대학교)
등록일 2018.09.18
자료번호 BRIC VIEW 2018-T34
조회 1900  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
수술, 화학치료, 방사선치료로 대표될 수 있는 3대 암치료법의 패러다임을 바꿀 수 있는 제 4의 암치료법인 면역치료에 대한 움직임이 활발하다. 본 리포트에서는 항체를 바탕으로 한 암 면역치료에 대한 개념 설명을 시작으로하여, 1)유전자 클로닝을 통하여 원하는 형태로 자유자재로 디자인 가능하며 2)대장균을 형질전환하여 대량으로 작성 가능하고 3)자연항체 보다 크기가 작다는 장점 가진 재조합 항체 단편을 면역치료에 이용 가능한 연구결과를 정리하였다.
키워드: antibody fragment, cancer immunotherapy, antibody engineering, protein tagging, immune checkpoint
분야: Cancer Biology/Oncology, Immunology, Biotechnology
목차

1. 서론
2. 본론
  2.1 재조합 항체 단편
    2.1.1 전체 항체 및 항체 단편
    2.1.2 절단에 의한 항체 단편화
    2.1.3 유전자 클로닝을 통한 재조합 항체 단편 작성
  2.2 면역관문억제제
  2.3 재조합 항체 단편을 이용한 면역치료
3. 결론
4. 참고문헌


1. 서론

암을 치료하기 위한 대표적인 방법은 수술, 화학치료, 방사선치료라 말할 수 있다. 이러한 3대 암치료의 뒤를 잇는 제4의 암치료법으로 최근 주목받고 있는 것이 면역치료(immuno therapy)이다 [2]. 1990년대까지 알려진 면역치료는 인체 내부 ‘전체’의 면역력을 높여 암과 싸우도록 하는 방법이 사용되었는데, 활성화림프구치료법(LAK요법, CAT요법 및 NK세포치료법), 인터페론(IFN-a, IFN-b, IFN-g) 및 인터로이킨(IL-2) 등을 사용하는 cytokine 치료법을 예로 들 수 있다. 하지만 이러한 방법은 암세포 특이적이 아니라 체내 전체의 면역력을 높이는 비특이적 치료법이었기 때문에 어느정도 진행이 된 암치료에 있어서는 한계를 나타내었다. 1990년에 접어들어 면역세포가 암세포를 공격하는 메커니즘이 밝혀지면서 면역세포를 활성화시켜 정상세포에는 영향을 미치지 않으며 암세포만을 공격하도록 하는 암세포 특이적 치료법 및 면역응답을 제어하는 분자의 활성을 억제하는 방법을 이용하는 치료법이 제안되기 시작되었고, 이들을 통하여 암 면역치료법이 비약적으로 발전되었다 [3].

전자인 면역세포가 암세포를 공격하는 기능을 활성화하는 대표적인 치료법으로 수지상세포 백신치료법을 들 수 있는데, 암세포를 인지하는 신호를 수지상세포가 림파구에 전달하여 암을 공격하는 면역시스템을 이용한 것이다. 이렇게 세포를 사용하여 면역력을 증가시키는 방법 외에 항체를 사용하여 면역력을 증가시키는 방법이 주목을 받고 있는데, 대표적으로 Rituximab는 B 세포 표면에 발현하는 CD20이라는 단백질을 인식하는 항체로 CD20에 결합하여 암세포화된 B 세포의 증식을 억제한다. 이와 비슷한 원리의 항암제로 Trastuzumab(사람 종양유전자인 Her2/neu의 유전자산물인 HER2 단백질에 특이적으로 결합함으로써 항종양효과를 나타내는 항암제) 등이 있다. 후자인 면역억제를 제어하는 방법은 PDL1 및 CTLA4와 같은 면역체크포인트를 저해하는 물질로 항체를 이용하는 것이 요점이 되는데, 대표적으로 항PDL1항체(Nivolumab, Pembrolizumab), 항CTLA4항체(ipilimumab)를 들 수 있다. 이러한 면역체크포인트억제제는 직접 암세포를 공격하는 것이 아니라 암세포를 공격하는 T 세포의 활성을 억제하는 분자의 활동을 저해하는 기능을 하기 때문에 T 세포는 암세포에 대항하는 본래의 공격성을 되찾을 수 있게 되어 항암효과를 나타낸다. 또한 상기한 두가지 치료법을 병용함으로써 치료 효과를 높일 수 있다.

본 리포트에서 다룰 내용은 최근에 그 효용성이 부각되고 있는 면역응답을 억제하는 분자의 활성을 제한하는 항체를 이용한 암면역치료법에 관한 최근의 연구 동향이 되겠다. 특히 항체중에서도 그 크기가 작고 유전자 클로닝을 통해 대량생산이 가능한 재조합 항체 단편(recombinant antibody fragment)을 이용한 방법에 초점을 두어 설명하고자 한다.

2. 본론

2.1 재조합 항체 단편

2.1.1 전체 항체(Full-sized antibody) 및 항체 단편(Antibody fragment)

항체는 Y자 형태로 간략히 표현될 수 있는데, 한개의 H chain (Heavy chain)과 두개의 L chain (Light chain)으로 구성된다. 또한 항체 중에서 항원이 결합하는 부위를 가변 영역(Variable region) 이라 하고 그 외의 부분을 정상 영역(Constant region)이라 하는데, 이들의 초기 알파벳을 조합하여 VH, VL, CH (항원결합부위에서 가까운 쪽에서부터 CH1, CH2, CH3), CL로 명명한다.

항체의 크기는 약 150 kDa인데 이보다 더 작은 크기의 항체가 필요할 경우 Fv (VH+VL), scFv (VH와 VL을 펩타이드 링커로 연결, Fv보다 항원결합력이 강함) 또는 Fab (VH+CH1과 VL+CL을 disulfide bond로 연결)와 같은 항체 단편을 사용할 수 있는데, 이들 항체 단편은 항원결합부위를 갖고 있으면서도 그 크기가 각각 약 25 kDa, 25 kDa, 50 kDa으로 Y자 형태를 띄는 전체 항체보다 작기 때문이다. 뿐만 아니라 Immunohistochemistry 및 Flow cytometry analysis를 사용하는 세포 실험에 항체가 사용될 경우 Fc (H chain 중에서 VH+CH1 이외의 부분, 즉 CH2+CH3으로 이루어진 항체의 밑기둥 부분) 수용체를 포함하는 세포를 사용하게 되면 비특이적 반응이 발생할 수 있기 때문에 이러한 경우에 Fc가 제거된 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다.

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그림 1. 사람 및 마우스 등에서 발현되는 자연 항체 및 항체 단편의 모식도.



2.1.2 절단에 의한 항체 단편화

자연 항체를 충분히 확보한 경우라면 자연 항체를 잘라낸 후 원하는 항체 단편만을 회수하는 방법으로 간단하게 항체 단편을 얻을 수 있다. Papain이라는 단백질분해효소를 이용하여 항체를 한개의 Fab와 한개의 Fc로 절단할 수 있다. 또한 Pepsin이라는 효소를 이용하면 전체 항체를 Fab 두개가 Hinge 부위(disulfide bonding 결합 부위)로 연결된 F(ab’)2와 다수의 작은 Fc 단편으로 절단할 수 있다. 최종적으로 얻고자 하는 항체 단편의 구조(Fab 또는 F(ab’)2 등)에 맞춰서 Papain 또는 Pepsin 등의 효소를 선택할 수 있으며, 효소와 항체를 섞은 후 37도에서 한 두시간 효소 반응을 통하여 절단을 한 후에 항체의 Fc 영역과 강한 결합력을 갖는 Protein A 또는 Protein G라는 이름의 단백질이 비드 위에 고정화된 컬럼을 사용하면 Fc 및 절단되지 않은 항체를 걸러내고 Fab/F(ab’)2만을 회수할 수 있다. 상기한 효소 및 Protein A 또는 Protein G 정제 컬럼은 손쉽게 구할 수 있고, 그 사용방법은 복잡하지 않고 잘 정립되어 있으므로 이러한 방법을 이용하면 간편하게 항체로부터 항체 단편을 얻을 수 있다.

하지만 전체 항체를 절단하여 항체 단편을 얻는 경우의 큰 한계점은 최종적으로 회수 가능한 원하는 항체 단편의 양만큼의(실제로는 정제 등에서 일어나는 손실을 고려하면 원하는 항체 단편의 양 이상의) 전체 항체가 필요하다는 점이다. 전체 항체를 작성하는 방법은 일반적으로 마우스, 토끼와 같은 면역동물에 항원을 주사한 후에 면역동물의 B 세포(B 세포가 분화한 플라즈마세포로부터 항체가 생산됨)를 채취한 후 골수암세포(반영구적으로 분열됨)와 세포융합을 함으로써 반영구적으로 분열하며 항체를 생산하는 하이브리마세포를 얻고, 하이브리도마세포를 한 개씩 배양한 후 얻어지는 클론(한개의 세포 당 한가지 항체만 생산됨)으로부터 단일클론항체를 여러가지 얻을 수 있으며, 그중 항원과의 결합성이 높은 단일클론항체를 ELISA를 통하여 선별한다. 이러한 일련의 항체생산과정을 진행하는데 있어서 특히 하이브리도마세포를 생산하기 위해서는 암세포 배양 시설이 필요하며 하이브리도마세포에서 얻을 수 있는 항체의 양은 제한적인 점으로부터 필요에 따라 전체 항체를 저가로 대량 생산하기에는 설비 및 비용적인 면에서 제약을 받는다.

2.1.3 유전자 클로닝을 통한 재조합 항체 단편 작성

원하는 항체 단편을 의료 및 산업분야 등의 실생활에서 사용하기 위해서는 대량으로 생산하는 것이 필요하다. 전술한 하이브리도마로부터 대량으로 항체를 생산하고 그로부터 대량으로 항체 단편을 얻는 방법의 단점을 해결할 수 있는 방법이 소량으로 항체를 생산하여 항체의 유전자배열만을 얻어내고 그 배열을 바탕으로 유전자를 클로닝하고 대장균에 도입하여 항체 단편을 대량으로 생산하는 방법이다. 즉, 항원과 강하게 결합하는 단일클론항체를 선별하여 생산한 후, 그 항체의 염기 배열 정보를 얻어내면 자연 항체의 역할은 거의 다 한 것이라 여겨도 무방하다 (물론 이후의 단계에서 작성하는 재조합 항체 단편의 활성을 비교판단하기 위한 대조군으로 자연 항체가 사용될 수 있다). 얻어낸 항체 전체 또는 가변 영역의 염기 배열을 PCR로 증폭한 후 발현 백터에 도입하여 DNA plasmid를 완성한 후 이를 이용하여 대장균을 형질변환하여 항체를 대량 생산할 수 있다. 이때 파지미드백터를 이용하여 panning 단계를 거치는 phage display법을 사용하면 하이브리도마를 통해 생산된 항체보다 항원결합력이 우수한 항체를 선별할 수도 있다.

항체 배열을 바탕으로 한 재조합 항체 단편 작성의 장점은, 대장균을 이용하여 항체 단편을 발현시키기 때문에 대량으로 저가 생산이 가능하다는 점이다. 또다른 장점중의 하나는 유전자 클로닝을 행할 때 항체 단편 이외의 배열을 항체 단편의 배열에 연결시켜 발현시킬 수 있다는 점이다. 예를 들어 발현된 항체 단편의 정제를 위해 필요한 His 태그를 항체 단편의 말단에 추가할 수 있으며, 형광 색소 또는 방사능동위원소 등을 붙일 수 있는 태그를 추가함으로써 항체 단편을 이미징 센서로 이용할 수 있다. 또한 특정 기능을 갖는 단백질 및 펩타이드의 배열을 항체 단편 전후로 추가하여 항체와 공(共)발현시킬 수가 있으므로 단백질 및 펩타이드의 기능과 항체 단편의 기능을 통시에 취할 수 있다. 그리고 재조합 항체 단편 기법을 사용하여 복수의 서로 다른 항체 단편을 연결하여 동시에 발현시킬 수 있다. 재조합 항체 단편을 이용한 면역치료법은 이렇게 항체 단편 전후로 암치료에 유용한 단백질 또는 펩타이드를 연결시킨 항체-약물 결합체(antibody-drug conjugate, ADC)를 이용하는 개념 및 다른 종류의 항체단편으로 구성된 융합항체단편 (bispecific antibody fragment)을 이용하는 개념이다.

2.2 면역관문억제제

최근 항CTLA4항체 및 항PD1항체, 항PDL1항체와 같은 면역관문인식항체를 면역관문억제제로 사용하는 항암치료법이 주목받고 있다. 면역세포의 표면에 발현하는 CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)가 수지상세포의 표면에 발현하는 CD80 및 CD86과 결합하면 면역세포의 활성이 저해된다. 체내에 항CTLA4항체를 투여하면 CTLA4에 항체가 결합하므로 CTLA4는 CD80 및 CD86과 결합할 수 없게 되고 결과적으로 면역세포의 활성이 저하되는 것을 억제할 수 있어 면역세포가 암세포를 공격하는 반응이 강화된다.

CTLA4와 유사한 반응이 면역세포상에 존재하는 PD1 (Programmed cell death protein1)에서도 나타난다. 암 세포의 표면에 존재하는 PDL1 (Programmed death-ligand 1)은 PD1과 결합하여 면역세포의 활성을 억제한다. 따라서 PD1을 인식하는 항PD1항체를 투여함으로서 PDL1과 PD1과의 반응이 저해되고 면역세포의 활성을 증가시킬 수 있고 이를 사용하여 종양에 대한 면역기능을 증가시킬 수 있다. PD1을 인식하는 항체인 nivolumab와 pembrolizumab, CTLA를 인식하는 항체인 ipilimumab가 각각 옵티브, 키트루다, 여보이라는 상품명으로 각각 2014년, 2014년, 2011년에 판매 허가되었고, nivolumab 투여시 흑색종 환자의 1년 후 생존율이 72.9%이었으며 ipilimumab 투여시 19%로 보고되고 있다 [4]. 또한 두가지 약제를 병용투여하는 임상실험이 활발히 진행중인데, nivolumab 후에 ipilimumab를 투여하였을 경우의 1년 생존율은 76%이고, ipilimumab를 사용한 후에 nivolumab으로 대체하였을 경우의 1년 생존율은 54%를 나타낸 점으로부터 약을 투여하는 순서가 효율성에 영향을 미침을 알 수 있다 [5]. 하지만 현재 시판중인 항체를 이용한 면역관문억제제는 매우 고가의 약제라는 점이 문제된다. 1년간 상기 면역관문억제제를 투여하는 치료를 받을 경우 치료제 비용만 약 1억원이 필요한 실정이다. 따라서 보다 일반적으로 사용될 수 있는 면역관문인식항체를 이용하는 종양치료법의 개발이 필요하다.

2.3 재조합 항체 단편을 이용한 면역치료

면역체크포인트를 인식하는 자연 항체 및 그 항체에 약물을 결합시킨 항체약물결합체 (ADC)를 이용한 면역치료에 대해서는 선행 보고된 브릭 동향리포트 [6] 및 관련 리뷰 논문 등이 참고가 될 것이다. 본 리포트에서는 재조합 항체 단편을 이용한 면역치료에 대한 주목할 만한 최신 연구에 대해 소개하고자 한다.

2016년 Hendriks 연구그룹에서는 PDL1을 인식하는 scFv형 항체 단편에 TNF-related Apoptosis Inducing Ligand (TRAIL)을 유전자재조합으로 연결한 융합단백질을 작성하였고 항암치료제로서 유효성을 보일 수 있음을 나타내었고, PDL1이외에도 T 세포 표면에 발현하는 PDL1, CTLA4, TIM3, LAG3와 같은 면역체크포인트분자와 TRAIL을 연결한 융합단백질 작성 응용될 수 있음을 나타내었다 [7, 8] (그림 2).

또다른 예로는 PD1을 인식하는 scFv형 재조합 항체 단편의 말단에 immune-tolerant elastin-like polypeptide (iTEP)을 융합하여 iTEP을 매개로 나노파티클에 항PD1 scFv가 self-assemble되도록 한 연구내용이다. 그 결과 PD1 발현 면역세포에 선택적으로 나노파티클이 분포하게 되었고, 항암치료에 사용되는 나노파티클에 응용가능함을 시사하였다 [1] (그림 3).

그리고 Kalos 그룹에서 최근 발표한 PDL1 인식 항체는 PDL1과 강하게 결합하여 PD1과 CD80의 활성을 저해하도록 human scFv phage display library에서 선별한것으로 이 배열을 바탕으로 한 각종 재조합 항체 단편의 작성이 기대된다 [9].

또한, PDL1과 PD1을 인식하는 항체 각각의 VH와 VL이 결합하여 작성한 bispecific scFv 항체 단편(CEA/CD3 bispecific antibody)가 T 세포의 cytotoicity를 증가시킴이 밝혀졌다 [10]. 이외에도 두가지의 항체 단편을 연결함으로서 양쪽 항원을 동시에 인식 가능한 bispecifc 항체를 항암치료에 사용한 예를 정리하면 다음 표와 같이 나타낼 수 있다 [11].

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낙타과 동물인 알파카에서 발현되는 항체는 H chain으로만 이루어졌으며 그중 항원이 결합하는 부위인 VHH는 그 크기가 약 15 kDa으로 nanobody로 불리운다. 이러한 VHH도 상기한 방법에 의해 알파카에 항원을 면역시켜 얻어지는 항체의 배열로부터 유전자 클로닝에 의해 대량생산이 가능하다.

VHH를 이용한 면역치료를 두가지로 나누면[20], 첫번째는 알려진 종양항원을 표적으로 하는 VHH를 이용하는 것으로 Epithelial growth factor receptor [21], carcinoembryonic antigen (태아종양항원, 태아의 장관과 성인암세포 조직에서 특이적으로 발현) [22], 전립선 특이 막 항원, 항VGF/Ang2항체, TNFa항체 등을 들 수 있다. 두번째로 면역관문억제제를 타겟으로 하여 VHH를 이용하는 것인데, 그에 관한 최신 연구결과로 PDL1 인식 VHH [23, 24], CD47 인식 VHH [25, 26]를 예로 들 수 있다.

이중에서 PDL1 인식 VHH을 면역치료에 이용하는 예[24]에 관하여 보다 자세히 설명하면 다음과 같다. PDL1을 알파카에 주사하여 면역시켜 항체 라이브러리를 작성한 후 그 중 항원 (PDL1)과 높은 결합성을 갖는 항체를 phage display와 panning을 이용하여 선별하였다. 선별한 항체 구조 중의 VHH에 해당하는 부분의 배열을 PCR을 이용하여 확보하고, 유전자 재조합 클로닝을 통하여 대장균 발현 벡터에 VHH발현 배열을 삽입하였다. 이때 동일 벡터에 삽입하는 것이 바로 면역치료에 사용하는 cytokine이다. Cytokine은 크기가 약 15 kDa 정도가 되는 단백질이며 본 연구에서 사용한 IFNg와 IL2는 그 DNA 배열이 알려져 있는 점을 바탕으로 유전자 클로닝이 가능하다. 본 연구에서는 PDL1을 인식하는 VHH의 DNA 배열의 C 말단 부위에 IFNg 또는 IL2의 DNA 배열을 연결하여 하나의 대장균 발현 백터에 삽입하여 최종적으로 VHH와 IFNg/IL2가 연결된 융합단백질이 발현되도록 하였다. 단백질 발현 및 정제 조건의 최적화를 거쳐 1L 배양시 약 20 mg의 정제단백질을 얻을 수 있는 대량생산 조건을 확립하였고, 특히 불용성 성분을 Guanidine 또는 Urea와 같은 변성제를 통하여 가용성화한 것이 아니라 대장균에서 발현된 단백질이 가용성이었으므로 단백질의 대량 배양 및 정제가 3일안에 완료한다는 장점을 갖는다. 작성한 VHH-cytokine 융합단백질을 췌장암마우스에 투여한 후의 췌장암의 크기 및 질량을 측정한 결과 본 연구에서 작성한 융합단백질을 투여하였을 때 췌장암의 크기가 육안으로 파악될 정도로 두드러지게 감소하였고, 질량 또한 감소하였음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라 마우스의 생존율도 25% 증가하였음을 알 수 있었다.

이러한 결과는 본 연구에서 개발한 융합단백질의 개념이 대량으로(즉, 저가로) 생산 가능한 췌장암 항암치료제로 응용될 수 있음을 시사한다. 상기한 연구에서는 PDL1을 타겟으로 하였지만, 더 나아가서는 PDL1 이외의 각종 면역체크포인트(PD1, CTLA4 등)을 인식하는 항체를 작성하여 사용하면 다양한 바이오마커를 타겟으로 할 수 있으며, cytokine의 풀 중에서 보다 치료효과가 좋은 물질을 선별하여 VHH에 연결시킴으로써 약효의 증가를 기대할 수 있겠다. 또한 융합단백질을 단일로 사용하는 것이 아니라 두개 이상을 병용사용하거나 bispecific한 항체를 사용함으로써 치료효과를 증가시킬 수 있다고 예상한다. 이러한 점이 더욱 발전되어 궁극적으로는 췌장암뿐만이 아니라 흑색종피부암 등을 포함한 각종 항암 치료제로 사용 될 수 있는 무한한 가능성을 지녔다고 말할 수 있겠다.

3. 결론

면역치료에 대한 연구가 비약적으로 증가하고 있으며, 약제로 개발이 되어 실제로 암을 치료하는데 효과적으로 사용되고 있음이 잇달아 보고되고 있다. 특히 이러한 혁신적인 연구가 최근 5년이라는 짧은 기간 동안에 그 성과를 나타내고 있다는 점은 놀라움을 더한다. 항체를 이용하는 암 면역치료는 종래의 방법에 비해 부작용이 적고 그 효능이 오랫동안 지속된다는 장점이 있지만 궁극적으로 지향하는 바는 부작용 0%, 치료율 100%이고, 이를 위해서는 보다 정확하고 확실한 방법의 모색이 필요하다. 그와 함께 고려되어야 할 것이 바로 비용이다. 효능이 좋은 치료제가 있어도 고가의 비용이 요구된다면 일반인들이 사용하는데 있어서 제약이 따르기 때문이다.

이러한 점에서 생각하였을 때, 재조합 항체 단편은 그 크기가 작아 고도로 밀집된 암세포 사이로 침투할 수 있는 가능성이 높고, 원하는 형태로 디자인이 가능할 뿐만 아니라 약물 또는 타항체와 융합될 수 있기 때문에 다기능성을 가지며, 대장균 등을 이용하여 대량으로 생산 가능하다는 장점을 갖는다. 최근 들어 이러한 장점이 부각되기 시작하면서 재조합 항체 단편을 이용한 면역치료법에 관한 관심이 늘어나고 있으며, 수년 이내에 상기한 장점을 두루 갖춘 면역치료제가 실용화 되는 것이 기대된다.

4. 참고문헌

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정희진(2018). 재조합 항체 단편을 이용한 암 면역치료(Recombinant antibody fragment-based cancer immunotherapy). BRIC View 2018-T34. Available from http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3080 (Sep 18, 2018)
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