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동맥경화 진단을 위한 새로운 형광물질 발견
의학약학 기초과학연구원 (2019-03-08 11:02)

동맥에 퇴행성 변화가 일어나면서 혈관이 좁아지고, 탄력이 떨어지는 동맥경화는 나이가 들수록 발병하기 쉬운 질환이다. 최근에는 생활습관 변화로 인해 젊은 나이에 발생하거나, 증상이 없는 뇌혈관 동맥경화 환자가 늘고 있는 추세다. 정확한 진단이 치료와 예방에 중요하다는 의미다.

동맥경화 진단 정확성을 높일 수 있는 새로운 기술이 나왔다. 기초과학연구원(IBS) 복잡계 자기조립 연구단(단장 김기문) 장영태 부연구단장(포항공대 화학과 교수) 팀은 IBS 유전체 교정 연구단의 김진수 수석연구위원 팀 및 싱가포르 연구진 등 국제 공동연구를 통해 활성화대식세포만을 선택적으로 염색하는 형광물질 ‘CDg16(Compound Designation green 16)’을 발견했다.

체내 면역을 담당하는 대식세포(macrophage)는 염증반응의 신호탄으로 불린다. 체내 침입 물질을 감지했을 때 대식세포가 활성화대식세포로 분화하며 항원을 만들어내기 때문이다. 동맥경화는 물론 알츠하이머병, 간염, 암 등의 질환을 유발하는 정확한 염증부위를 파악하기 위해서는 활성화대식세포가 가장 좋은 타겟이 될 수 있다.

생체 내에서 활성화대식세포를 얼마나 선별적으로 정확히 검출해낼 수 있는지가 염증질환의 정확한 진단 및 치료의 관건이 된다. 하지만 활성화대식세포만을 선택적으로 염색하는 탐지기(probe) 개발은 어려운 과제다. 기존 개발된 유수의 형광분자들은 생체 내 활용이 어려워 살아있는 조직에서 활성화대식세포를 선별하는 데 한계가 있었다.

장영태 부연구단장 팀은 자체개발한 8200여 종류의 형광 유기 분자 라이브러리를 탐색해, 활성화대식세포만을 선택적으로 염색하는 화합물을 찾아내고, CDg16이라 명명했다. 아울러 CDg16이 활성화대식세포 내 리소좀을 염색하고, 세포독성이 거의 없다는 것을 검증했다.

이어 동맥경화를 유발시킨 실험쥐를 활용해 CDg16의 효능을 검증했다. 동맥경화 모델로는 비만, 동맥경화, 심혈관질환, 치매 등을 유발한다고 알려진 ApoE 유전자 제거(knock-out) 동물을 사용했다. 이후 동맥경화 생쥐의 꼬리정맥으로 CDg16을 주사했다. 면역화학염색법을 통한 검증 결과, CDg16이 생쥐의 죽상경화판에서 활성화대식세포를 선택적으로 염색하는 것을 확인했다. 실험에 활용된 생쥐의 경우 죽상경화판이 동맥경화를 유발한 정확한 염증부위라는 의미다.

일반적으로 특정 염증부위를 이미징하기 위한 약물이나 탐지기는 선택적으로 결합하는 타겟 단백질이 있다. 연구진은 다른 탐지기들과 달리 이번에 개발한 CDg16은 특정한 결합단백질이 없어도 세포 내에서 운반되는 것을 발견했다. 우리 몸 속 세포에는 약 450개 정도의 막운반체가 있는 것으로 알려져 있는데, 연구진은 이 중 물질을 세포내로 운반하는 SLC 단백질 중에 CDg16을 전달하는 시스템이 있을 것으로 예상했다.

이를 증명하기 위해 IBS 유전체 교정 연구단과 함께 추가 실험을 진행했다. 연구진은 특정 유전자 발현을 활성화시킬 수 있는 활성크리스퍼 시스템(CRISPRa system)을 이용해 380여 개의 SLC 유전자가 무작위하게 과발현시켰다. RNA 염기서열 분석으로 확인한 결과, 기존에 기능이 알려지지 않았던 SLC18B1 유전자가 CDg16 염색에 관여한다는 메커니즘을 새로 규명했다.

기존 탐지기들처럼 특정 단백질 하나와 결합하며 선택성을 획득하는 것이 아니라, 활성대식세포에서 과발현된 SLC18B1 막운반체를 통해 CDg16이 활성화대식세포에 직접 들어가서 염색한다는 것이다. 이는 기존 탐지기들과 전혀 다른 새로운 메커니즘으로 한 단백질 타겟에 하나씩 붙는 기존 방식에 비해 막운반체는 다수의 탐지기를 수송할 수 있으므로 더 뚜렷한 신호를 관찰할 수 있다는 장점이 있다.

장영태 부연구단장은 “IBS 연구단 간의 공동연구를 토대로 고속효율 스크리닝과 유전자 조작 기술을 결합한 결과 이같은 성과를 올릴 수 있었다”며 “활성화대식세포를 선택적으로 염색하는 형광물질은 향후 다양한 염증성 질환의 진단 및 약물 개발을 견인할 것”이라고 말했다.

연구결과는 국제학술지 네이처 커뮤니케이션즈(Nature Communications, IF 12.353) 온라인 판에 3월 7일 19시(한국시간)에 게재됐다.

논문명/저널명
Imaging inflammation using an activated macrophage probe with Slc18b1 as the activation-selective gating target
/ Nature Communications

저자정보

Sung-Jin Park, Beomsue Kim, Sejong Choi, Sivaraman Balasubramaniam, Sung-Chan Lee, Jung Yeol Lee, Heon Seok Kim, Jun-Young Kim, Jong-Jin Kim, Yong-An Lee, Nam-Young Kang, Jin-Soo Kim, & Young-Tae Chang

연구이야기

[연구 내용]
자체 개발한 형광분자 라이브러리를 활성화대식세포에만 선택성을 갖는 형광분자를 스크리닝 방법으로 골라내고, 추가로 사람 대식세포주와 생쥐 대식세포 테스트로. 활성화대식세포만을 염색하는 CDg16 탐지기를 개발했다. CDg16의 활성화대식세포의 선택성을 검증하고 동맥경화 동물모델에 CDg16을 꼬리정맥 주사하여 죽상경화판내 활성화대식세포의 선택성을 면역조직화학법을 통하여 검증했다. 다른 장기들에서의 CDg16 염색성을 비교해, CDg16이 염증부위에 높은 선택성을 갖는 것을 확인했다. 아울러, SLC-CRISPRa 시스템을 개발해 CDg16 작용기전을 밝혀냈다.

[연구 배경] 질환에 따른 정확한 염증부위를 알아내기 위해서는 활성화대식세포가 가장 좋은 타겟이다. 활성화대식세포가 항원제시기능으로 면역반응의 시작과, 포식작용을 통한 면역반응의 마지막을 담당하기 때문이다. 그러나 활성화대식세포만을 선택적으로 염색하는 탐지기를 개발하는 것은 어려운 과제다. 따라서 우리 연구진은 자체 개발한 형광분자 라이브러리를 이용하여 활성화대식세포만을 염색하는 탐지기를 개발했고, 대표적 염증질환인  동맥경화 동물모델에 적용하여 CDg16의 염증 이미징 가능성을 확인하였으며, 아울러 CDg16의 작용기전 연구를 하였다.

[연구 과정] 다양한 형광분자 라이브러리를 만들고, 스크리닝을 위한 셋업과 적절한 실험군/대조군을 만드는 것이 세포 선택성을 갖는 탐지물질 개발에 중요한 요소다. 비활성대식세포와 활성화대식세포를 스크리닝 하기 위한 방법으로 최적화시키는 것부터 시작해 8200여 개의 형광분자 테스트로 4가지 후보 물질을 찾았고, 최종적으로 두 개의 후보물질을 결정했다. 이후 동물실험을 통해 최종적으로 CDg16을 선택하게 됐다. 후속 검증실험인 SLC18B1 knock-out 실험을 통하여 최종적으로 CDg16의 작용기전이 Slc16b1/SLC18B1에 관여하는 것을 검증하였다.

[어려웠던 점] 한 세포에서 분화된 세포를 원래의 세포와 구별하는 것은 많은 시간과 노력을 요하는 일이었다. 동물 적용을 위해 다양한 조건을 통해 최적의 조건을 탐색하는 과정도 상당히 어려웠다. 시험관 세포 실험에서 동물 실험으로 옮겨가는 과정에 많은 장애물이 있는 것을 다시 한 번 깨달았다. 다양한 조건과 방법을 시도해 많은 노하우를 축적할 수 있었다.

[향후 연구계획] 다양한 염증질환에서의 CDg16 적용을 연구할 계획이며, CDg16의 구조적 변이를 통한 기능 연구 및 SLC를 이용한 다양한 적용 방법을 모색할 예정이다.

활성화대식세포를 선택적으로 염색하는 형광물질 개발
[그림1] 활성화대식세포를 선택적으로 염색하는 형광물질 개발
연구진은 자체 개발한 8200여 개의 형광 유기 분자 라이브러리를 스크리닝해 활성화대식세포를 선택적으로 염색할 수 있는 새로운 형광물질 CDg16을 발견했다(a). 세포주(b, 왼쪽) 및 동물유래(b, 오른쪽) 활성화대식세포가 CDg16에 의해 염색되어지는 모습을 관찰할 수 있다(b).

동물실험을 통한 CDg16 효능 확인
[그림2] 동물실험을 통한 CDg16 효능 확인
연구진은 동맥경화를 유발시킨 실험쥐를 제작하고, 실험쥐의 꼬리를 통해 CDg16을 주사했다(a). 실험쥐의 발에서 CDg16과 활성화대식세포 마커인 CD86 항체가 동시에 염색되는 양상을 보여주고 있다(b).

동맥경화 동물모델에 CDg16 적용한 모습
[그림3] 동맥경화 동물모델에 CDg16 적용한 모습
CDg16을 꼬리정맥 주사한 뒤(a) 동맥활 근처의 죽상경화판에서 CDg16이 염색됨을 관찰했다(b). 적출한 대동맥들 중에서, 동맥경화 모델에 CDg16을 주사한 대동맥에서만(맨 오른쪽) CDg16이 염색된 부위가 보이는 것을 확인했다.

활성화크리스퍼 시스템을 이용한 CDg16 작용기전 규명
[그림4] 활성화크리스퍼 시스템을 이용한 CDg16 작용기전 규명
물질을 세포내로 운반하는 SLC를 과발현시키는 활성화크리스퍼시스템 구축을 위한 모식도(a). 후보물질 중 SLC18B1 만이 CDg16에 반응하는 것을 확인했다(b). 결과적으로 CDg16이 활성화대식세포를 선택적으로 염색하는 것은 세포내 리소좀에 있는 SLC18B1이 과발현되며 나타나는 것으로 밝혀졌다(c).

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