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여성의 두 번째 X 염색체 조절과정 규명
생명과학 한국연구재단 (2019-03-08 10:59)

남진우 교수(한양대)‧김형범 교수(연세대) 연구팀이 하버드 의대와 공동 연구를 통해, 인간 여성 세포에서 X 염색체 2개 중 하나가 불활성화되는 과정을 규명했다고 한국연구재단은 밝혔다.

여성은 X 염색체 2개, 남성은 X 염색체 1개와 Y 염색체 1개를 가지고 있다. 그럼에도 여성의 X 염색체들이 남성의 2배로 유전자를 발현하지는 않는다. 수정란이 약 1,000개로 세포 분열되는 시기부터 각 세포마다 무작위로 한 개의 X 염색체가 불활성화되기 때문이다.

연구팀은 효율적인 유전자 절단 방법을 이용해, X 염색체를 불활성화시키는 '지스트(Xist)‘라는 RNA를 체계적으로 분석했다. 이로써 기존에 밝혀진 생쥐의 지스트 유전자와 상이한, 인간 지스트 유전자의 기능과 활성부위를 구체적으로 밝혀냈다.

이는 크리스퍼(CRISPR/Cas9) 유전자가위 설계 시스템을 개발해 가능했다. 수백 개에서 수십만 개의 염기로 이루어진 긴 DNA 구간을 삭제할 수 있어, 삭제된 유전자 구간의 기능을 체계적으로 분석할 수 있다. 연구팀은 지스트 유전자의 전체 또는 부분을 절단한 후, 대규모 전사체 분석과 형광 이미지 분석을 수행했다.

연구 결과, 지스트 유전자에서 핵심 기능을 하는 구간이 생쥐는 반복서열 구간인 반면, 인간은 서열이 반복되지 않는 구간이다.

또한 생쥐와 달리 인간 지스트 유전자를 삭제했을 때 X 염색체 재활성화가 활발히 나타났다. 이는 X 염색체가 불활성화되어 발생하는 질병의 연구에 학술적‧의학적으로 크게 기여할 것으로 본다.

연구팀은 “암을 비롯한 다양한 질병에서 지스트 유전자 주요 부위의 변이와 X 염색체 재활성화 요인을 연구하여, 지스트 유전자와 질병 발생에 대한 이론적 근거를 정립할 계획”이라고 밝혔다.

이 연구는 과학기술정보통신부‧한국연구재단 기초연구사업(중견연구), 바이오‧의료기술개발사업의 지원으로 수행되었다. 분자유전학 및 유전체 분야 국제학술지 ‘뉴클레익 애시드 리서치(Nucleic Acids Research)’에 2월 20일 게재되었다.

□ 논문명, 저자정보

논문명
En bloc and segmental deletions of human XIST reveal X chromosome inactivation-involving RNA elements
저  자

이현주 연구원(제1저자, 한양대), 라무 박사(Ramu G., 제1저자, 연세대), 선우홍재 박사(제1저자, 하버드의대), 최서원(한양대), 수레쉬 교수(Suresh, 한양대), 지니 리(Jeannie T. Lee, 하버드의대),김형범 교수(교신저자, 연세대), 남진우 교수(교신저자, 한양대)

□ 연구의 주요내용

 1. 연구의 필요성

  ○ 세포 핵 내의 X 성염색체는 남성은 1개 여성은 2개가 존재하지만, 여성은 배아발생(약 1000 세포기) 단계에서 무작위적으로 한 개가 비활성화된 형태(inactive form; 바소체(bar body)라고도 함)로 변화되어, 결국 동일한 개수의 유전자 발현을 하도록(dosage compensation) 유도한다.
  ○ X 염색체 비활성화(X chromosome inactivation, XCI) 현상은 지난 수십 년간 생쥐에서 Xist 라는 긴 비번역 RNA(long noncoding RNA)에 의해서 조절됨이 밝혀졌다. 특히 Xist RNA상에 존재하는 반복서열(repeat element)이 염색체의 후성유전적(epigenetic) 비활성화를 유도하는 메커니즘이 잘 밝혀져 있다.
  ○ 그러나 인간의 세포에서 발현되는 Xist 유전자는 인간의 XCI를 조절한다고 믿어왔지만, 생쥐의 Xist 유전자와 어떻게 유사하게 또는 다르게 XCI를 조절하는지 정확한 메커니즘과 조절인자가 규명되지 못했다. 이러한 인간의 Xist에 의한 XCI의 현상과 조절메커니즘의 규명은, 인간의 초기발생 단계에서 후성유전적학적 유전자 발현조절 메커니즘을 이해하고, 더 나아가서는 XCI 비정상 작동에 의해 생기는 암을 포함한 다양한 질병을 이해하는 데 중요한 연구가 된다.
  ○ 인간의 세포에서 Xist에 의한 XCI 조절현상의 연구는 윤리적인 문제, 효율적인 Xist 유전자 삭제방법의 부재, 체계적인 유전자 발현 변화 분석의 어려움 등으로 인해 그동안 쉽지 않았다. 하지만 최근 CRISPR 시스템을 이용한 효율적인 특정 DNA 영역 삭제 방법의 개발과 NGS(차세대 염기서열 분석)를 이용해서 상동 염색체 중 특정 염색체에서 발현되는 RNA를 검색할 수 있는 기술이 개발되면서, 이 연구를 수행할 수 있게 되었다.

 2. 연구내용
  ○ 인간 세포에서 CRISPR/Cas9 쌍을 이용해 효율적으로 DNA 부분을 삭제할 수 있도록 도와주는 예측 시스템인 LINDEL을 자체 개발하였다.
      * LINDEL (http://big.hanyang.ac.kr/LINDEL)
  ○ LINDEL을 이용해 혈액암 세포에서 Xist 유전자 전체와 12곳의 부분 영역을 (수백 ~ 수십만 개의 염기) 효율적으로 삭제하는 데 성공하였다. 이중에 두 상동 X 염색체가 모두 삭제된 클론을 선별하여 라이브러리를 구축하였다.
  ○ RNA 기반 형광이미지, High-throughput RNA sequencing (RNA-seq) 기술을 이용해 XCI 현상에 영향을 주는 Xist 영역을 조사하여, 생쥐 Xist와 유사하게 Repeat E, B+C 영역이 XCI에 영향을 주는 것을 확인하였고, 특이하게도 인간 Xist 엑손 5는 생쥐와 다르게 XCI을 유지하는데 큰 역할을 하고 있음을 처음으로 규명하였다.
  ○ 특히 엑손 5를 삭제 했을 때 다른 염색체에는 영향이 없었지만 X 염색체의 유전자 발현이 크게 증가하는 재활성화 현상을 규명하였고, 이것은 비활성화된 X 염색체의 발현에 의한 현상임을 밝혔다.
  ○ 특히, 생쥐에서는 Xist를 삭제해도 X 염색체의 재활성화가 나타나지 않았지만, 인간의 X 염색체에서는 재활성화가 확인되면서 배아 발생단계에서 낮은 수준의 XCI의 현상임을 규명하였다.

 3. 연구성과/기대효과
  ○ 인간의 Xist에 의한 XCI의 현상과 조절메커니즘 연구는,
   1) 인간과 생쥐 사이의 Xist 유전자의 구조적/기능적 보존성과 변화를 규명함으로써, 비번역(noncoding) 유전자에 의한 인간 특이적인 후성유전적 유전자 발현 조절 현상에 대한 기초적인 이해를 넓힐 것이며,
   2) 인간의 초기발생 단계에서 Xist에 의한 후성유전적학적 유전자 발현조절 메커니즘을 이해하는데 도움을 줄 것이며,
   3) 인간 Xist 상에 존재하는 다양한 유전적 변이에 의한 질병 기전을 이해하는데 큰 역할을 하여, XCI 비정상 작동에 의해 생기는 암을 포함한 다양한 질병을 치료하는 기초자료로써 기여할 것으로 기대 된다.

여성의 두 번째 X 염색체 조절과정 규명
(그림) LINDEL 시스템을 이용한 Xist 유전자 전체/부분 삭제 및 기능 분석 모식도

󰊳 연구 이야기

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

인간과 생쥐에서 발현되는 Xist 유전자는 X 염색체 비활성화(XCI)를 조절한다고 알려져 왔지만, 인간과 생쥐의 Xist 유전자가 어떻게 유사하게 또는 다르게 XCI를 조절하는지 정확한 메커니즘과 조절인자가 규명되지 못했다. 이러한 인간의 Xist에 의한 XCI의 현상과 조절메커니즘의 규명은, 인간의 초기발생 단계에서 후성유전적학적 유전자 발현조절 메커니즘을 이해하고, 더 나아가서는 XCI 비정상 작동에 의해 생기는 암을 포함한 다양한 질병을 이해하는 데 중요한 연구가 될 것으로 판단되어 연구를 시작하게 되었다.

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

2014년 CRISPR/Cas9 시스템이 본격적으로 활용되기 시작하면서 gRNA(가이드 RNA) 쌍을 이용해 DNA의 특정 부분을 삭제하는 기술 개발에 초점을 맞추었다. 그 이유는 비번역 RNA인 Xist 유전자는 단백질 유전자와는 달리 임의의 개수의 염기 삽입 및 삭제를 통해 유전자 발현을 억제할 수 없기 때문에, 유전자 전체 영역이나 부분영역을 삭제할 수 있는 방법을 고안해야 했다. 다행스럽게도 200kb 이상의 영역을 효율적으로 삭제할 수 있는 시스템을 구축할 수 있었고, 연구 수행을 위한 Xist 삭제 세포를 모두 얻는데 3년이 넘게 소요가 되었다.

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소는 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

이 연구를 2016년 초반 “지놈 리서치(Genome Research)”에 투고하였다. 하지만, 비활성화 X 염색체의 재활성화 과정을 실험적으로 그리고 대규모 유전체 데이터를 이용해 규명하도록 요구하여, 1년에 넘은 추가 연구를 수행하게 되었다. 이 과정에서 제1저자인 석사 학생이 졸업하고 나가면서 세 개의 공동 연구팀을 직접 이끌며 연구를 수행하는 어려움을 겪어야 했고, 전체적으로 연구의 속도가 늦어지게 되는 상황이 생겼다. 하지만, 모든 연구진들이 적극적으로 도와주고, 믿어주었기 때문에 포기하지 않고 이 연구를 잘 마무리할 수 있었다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

인간세포에서 Xist의 유전자를 일부 삭제한 연구가 수행된 경우가 있었지만, 이 연구에서처럼 체계적으로 모두 삭제하여, 전사체 분석을 통해 기능 연구를 수행한 사례가 없었다. 이번 연구결과는 인간 Xist 유전자의 삭제가 X 염색체의 비활성화가 재활성화로 변화됨을 밝혔다는 게 큰 의의가 있다. 특히 생쥐에서는 이러한 재활성화 현상이 보고된 바가 없다.

□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는?

인간 Xist 상에 존재하는 다양한 유전적 변이가 X 염색체 비활성화에 어떠게 영향을 주는 지가 암을 포함한 다양한 질병에 영향을 줄 수 있을 것으로 기대된다. 특히 X 염색체 비활성화 과정에 역할을 하는 Xist의 비반복서열 및 반복서열 구간에 나타나는 염색체 구조변이/염기돌연변이 등에  의한 질병 기전을 이해하는데 큰 역할을 할 것으로 기대하고 있다. 이렇게, XCI 비정상 작동에 의해 생기는 암을 포함한 다양한 질병을 치료하는 연구의 초석이 될 것으로 기대된다.

□ 꼭 이루고 싶은 목표나 후속 연구계획은?

CRISPR/Cas9 gRNA 쌍 설계기술을 활용하여 다양한 중요 비번역 유전자의 기능을 규명하고자 한다. 이를 통해 수 만개의 기능이 밝혀지지 않은 비번역 유전자의 실체를 밝히는 것이 장기 목표이다.

□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?

하버드의대 공동연구팀인 지니 리(Jeannie T. Lee) 팀은 생쥐에서 이 연구와 유사한 연구를 수행하여 서로의 연구 정보를 공유하여 어려움이 있을 때마다 돌파구를 마련해 주었다.

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