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바이오통신원   
인간 세포에서 정확한 마이크로RNA 정보 읽어
생명과학 기초과학연구원 (2017-04-21 09:38)

기초과학연구원(IBS) RNA 연구단 김빛내리 단장 연구팀은 마이크로RNA가 드로셔(DROSHA) 단백질에 의해 형성되는 과정을 인체 세포 내에서 확인하는 데 성공했다. 연구팀은 드로셔 단백질이 마이크로RNA를 자르는 위치를 대량으로 정확하게 분석할 수 있는 새로운 실험법이 개발했다. 이 분석법을 통해 그간 알려져 있던 마이크로RNA(이하 miRNA)의 정보가 일부 부정확했음을 알리고, 드로셔와 마이크로RNA 각각의 새로운 특성들을 규명했다.

드로셔 단백질은 miRNA 1차 전구체를 특정 위치에서 자르는 효소로서, 지난 2003년 김빛내리 단장 연구팀에 의해 miRNA 생성에 필수적인 효소로 밝혀진 바 있다. 2016년 연구팀은 드로셔 단백질의 3차원 구조 규명에 주안점을 두고, 드로셔가 miRNA 1차 전구체의 어느 부위를 인식해 절단하는지에 관한 패턴을 일반화하는 데 성공했다.

드로셔의 구조와 일반적인 RNA 절단 패턴은 밝혀졌지만, 실제 인체 세포 내에서  드로셔에 의해 만들어지는 miRNA 각각에 관한 정보는 부족했다. 또한, 드로셔가 miRNA 생성을 주도하는 역할 외에 어떠한 기능이 있는지도 불명확했다. 여기에는 실험법적 한계가 있는데, 자외선을 이용해 RNA 결합 단백질에 붙은 표적 RNA의 염기서열을 분석하는 클립시크(CLIP-seq) 실험법은 드로셔 단백질에는 적용되지 않았기 때문이다.

이에 따라 본 연구진은 자외선이 아닌 포름알데히드(formaldehyde)를 이용하는 방식인 f-클립시크(fCLIP-seq)로 실험법을 대체했다. 포름알데히드는 RNA와 드로셔의 결합 부위에 끼어 들어가 둘을 이어주는데, 이 상태에서 드로셔에 특이적으로 결합하는 항체를 처리하면, 항원-항체반응으로 드로셔만을 모아 드로셔에 붙어있는 RNA 산물을 염기서열 분석법으로 읽어낼 수 있다. 연구팀은 사람의 배아 신장 세포와 자궁경부암 세포 두 종류를 대상으로 f-클립시크를 적용, 수 백 개에 달하는 miRNA 전구체 상 드로셔 절단 위치를 찾는데 성공했다.

본 실험에서 얻은 miRNA 데이터를 세계 최대의 miRNA 데이터베이스인 미르베이스(miRBase)와 비교한 결과, 드로셔가 만드는 miRNA 중 상당수가 불일치함을 확인했다. 미르베이스는 생성이 완료된 miRNA 만을 기준으로 하는데, 많은 miRNA가 생성되는 도중에 염기서열의 끝 부분에서 추가적인 변형이 일어나기 때문인 것으로 분석됐다. 또한, 동일한 miRNA 전구체라도 드로셔에 의해 각각 다른 부위가 절단돼 여러 종류의 miRNA(이성체)가 만들어질 수 있는데, 극소수의 miRNA에서만 이러한 현상이 보고됐던 것과 달리 이번 연구를 통해 실제로는 다수의 miRNA에서 일어난다는 사실을 증명했다.

또한, 연구진은 드로셔가 miRNA 전구체 외에 수십 종의 다른 RNA 종류도 자르는 것을 확인했다. miRNA 외에도 드로셔에 의해 기능이 조절되는 RNA들을 새롭게 찾아냄으로써 드로셔 역할에 대한 이해의 폭을 확장한 것이다.

드로셔는 RNA를 잘라 신경 발생이나 골수 형성 과정을 조절할 뿐만 아니라 바이러스의 증식을 억제하는 기능도 있는 것으로 보고돼 왔다. 김빛내리 단장은 “이번 연구는 드로셔가 결합하는 RNA를 정확히 찾아낼 수 있는 연구 방법을 제공함으로써, 생물학적으로 중요한 여러 현상들에서 드로셔의 기능을 규명할 길을 열 것으로 기대된다.”고 말했다. 향후 연구진은 본 연구대상 외의 다른 인체 세포에서도 드로셔에 의해 만들어지는 miRNA 정보를 밝혀나갈 계획이다.

본 연구결과는 몰레큘러 셀(Molecular Cell, IF=13.958)에 미국동부시간으로 4월 20일자에 게재됐다.

논문명
Genome-wide mapping of DROSHA cleavage sites on primary microRNAs and noncanonical substrates
(Molecular Cell, in press)


저자정보
Baekgyu Kim. Kyowon Jeong, V. Narry Kim

연구내용 보충설명
■ 연구진은 포름알데히드를 이용한 가교 결합 형성과 면역침전, 그리고 염기서열 분석 등을 기반으로 하여 f-클립시크(fCLIP-seq)라는 기법을 새로이 개발하였고, 이를 드로셔에 적용해서 드로셔의 절단 부위를 단일 염기수준으로 확인함.
■ 연구진은 드로셔가 miRNA 전구체 외에 수십 개의 다른 RNA 종류도 자르는 것을 확인함. 드로셔 절단 위치를 모르는 다른 RNA들에 드로셔의 miRNA 절단 위치 패턴을 적용하는 방식인데, 이는 RNA구조나 발현량 변화에 의존해 RNA를 탐색하던 기존 방법에 비해 훨씬 정밀한 방법.

기타사항
[어려웠던 점] 자외선을 사용하는 기존의 클립시크 방법이 드로셔 단백질에 잘 맞지 않았기 때문에, 이를 대체할 다른 방법으로 f-클립시크 방법을 개발하는 과정에 어려움 겪음. 여러 번의 시도 끝에 최적화된 실험 조건을 찾을 수 있었음. 또한 드로셔에 대한 f-클립시크의 실험결과로부터 마이크로RNA가 아닌 새로운 표적 RNA들을 선별적으로 찾아내는 것 또한 어려웠음. 유전체 전체에 퍼져 있을 드로셔의 절단 패턴을 찾아내려면 빠르면서도 선별적으로 패턴을 찾는 방법을 써야했는데, 여러 가지 알고리즘을 시도해본 결과 신호 처리 알고리즘인 정합 필터가 가장 효과적이라는 결론 얻음.

[성과 차별점] 마이크로RNA 전구체 상에서 드로셔의 절단 부위는 마이크로RNA 생성 과정을 연구하는데 있어 중요한 정보임에도 불구하고 기술적인 한계로 인해 극소수의 일부 마이크로RNA에 대해서만 알려져 있었음. 본 연구에서 개발한 f-클립시크는 이를 단 한 번의 실험만으로 수백 개에 달하는 마이크로RNA 전구체에 대해 단일 염기 수준까지 정확히 볼 수 있도록 하는 방법으로, 이를 위한 최적화된 실험 방법을 제시할 뿐만 아니라 최초로 이를 체계적으로 정리해서 후속 연구를 위한 기반 제공.

[향후 연구계획] 드로셔는 배아줄기세포나 뇌 조직에서 유독 발현양이 높기 때문에, 마이크로RNA의 생성뿐만 아니라 다른 표적 RNA의 절단을 관찰하면, 중요한 기능이 더 있을 것으로 기대됨. 따라서 f-클립시크의 방법을 적용해 드로셔가 배아 발생이나 뇌 발달과 관련해서 어떤 다른 역할을 하는지를 규명할 필요가 있음.

f-클립시크(fCLIP-seq)실험법에서의 드로셔 절단 패턴과 절단 위치
[그림 1] f-클립시크(fCLIP-seq)실험법에서의 드로셔 절단 패턴과 절단 위치

드로셔(갈색)는 표적 RNA의 머리 핀 모양의 구조를 두 곳에서 잘라 세 가지의 RNA 산물을 만들어낸다. 포름알데히드 처리를 하면 이 산물들과 드로셔 사이의 가교 결합이 형성되는데, 드로셔에 반응하는 항체로 드로셔를 모아 같이 붙어 나온 RNA 산물을 염기서열 분석법으로 읽어내면 위와 같은 절단 패턴이 얻어진다. 드로셔가 RNA를 자름으로써 산물이 만들어지므로, 거꾸로 절단된 RNA 조각들이 서로 만나는 위치가 바로 드로셔가 자르는 위치(삼각형)가 되는 것이다.

드로셔의 miRNA 절단 정보 수집으로 새롭게 발견한 드로셔와 miRNA 특성
[그림 2] 드로셔의 miRNA 절단 정보 수집으로 새롭게 발견한 드로셔와 miRNA 특성

마이크로RNA의 염기서열 끝은 드로셔 절단 위치와 일치할 것으로 간주되어왔으나 이번 실험의 마이크로RNA 데이터와 미르베이스의 데이터를 비교해본 결과 상당한 불일치가 관찰됐다. 이로부터 많은 마이크로RNA들이 생성 과정 중에 끝 부분에서 추가적인 변형을 겪는다는 것을 확인할 수 있었다. 동일한 miRNA 전구체라도 드로셔에 의해 각각 다른 부위가 절단돼 여러 종류의 miRNA(이성체)가 만들어질 수 있는데, 극소수의 miRNA에서만 이러한 현상이 보고됐던 것과 달리 이번 연구를 통해 실제로는 다수의 miRNA에서 일어난다는 사실을 증명했다. 뿐만 아니라 마이크로RNA 전구체가 아닌 수십 종의 서로 다른 RNA에서 드로셔에 의한 절단 위치를 찾아냄으로써, 이를 근거로 수십 개의 새로운 드로셔 표적 RNA들을 발견할 수 있었다.

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