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바이오산업 이끄는 산업 대장균의 최신 유전체 정보 확보
생명과학 한국연구재단 (2017-04-19 10:33)

한국연구재단은 윤성호 교수(건국대 시스템생명공학과) 연구팀이 유전체와 전사체*의 통합분석을 통해 바이오산업에 광범위하게 이용되는 산업 대장균(BL21(DE3)) 최신 유전체 정보를 확보하였다고 밝혔다.
     * 유전체와 전사체 : 유전체는 한 생물체의 유전 정보 전체를 말하며, 전사체는 한 세포 안에서 발현되는 RNA 전체를 뜻함. 유전체와 전사체의 통합분석은 서열해석, 유전자분석 및 네트워크 구조 등의 연구를 말함.

산업 대장균은 효소, 항체 등의 재조합 단백질과 함께 바이오화학제품과 바이오연료를 생산하는 미니 생체공장이라 불리고 있다. 대장균을 포함한 산업 미생물은 석유화학을 대체하는 친환경 바이오 제품의 생산에 기여할 수 있다.

지금까지는 산업 대장균의 유전자 기능 및 발현에 대한 정보가 부족하여 유전체 조작을 통한 생산공정 개발에 어려움이 있었다. 이에 따라 산업 대장균 내 모든 유전자의 종류와 기능을 밝히고 그 중 실제로 발현되는 유전자들의 시작 및 종결위치를 찾아내는 작업이 필요했다.

연구팀은 산업 대장균 BL21(DE3)의 유전체와 전사체를 통합분석하여 기존 유전자 정보를 업데이트하고 신규 유전자 37개와 비번역(non-coding) RNA* 66개를 발견함으로써 전사체맵*(transcriptome map)을 완성하였다.
     * 비번역(non-coding) RNA : 단백질로 번역되지 않고 여러 유전자들의 발현을 조절하는 RNA
     * 전사체맵 : 유전체 내 실제로 RNA로 발현되는 부분에 대한 위치 및 발현강도 정보

유전체와 전사체의 통합분석이란 유전체 염기서열 분석을 통해 유전자 종류 및 위치를 예측하고, 여러 실험조건에서 실제 RNA로 만들어지는 유전자 정보를 더해 유전체 주석화*를 보다 정확히 하는 방법이다.
     * 유전체 주석화 (genome annotation) : 유전체 내 포함된 유전자 기능과 위치를 결정함. 이는 해당 유기체의 과학적, 산업적 연구에 가장 기본적으로 이용되는 정보임.

이번 연구에서 사용한 다중 오믹스* 통합분석 기술은 다른 미생물의 유전체 분석에도 적용 가능하다.
     * 오믹스(omics) : 세포 또는 개체 내에서 발현되는 모든 유전자, RNA, 단백질, 대사물질 등 생명현상과 관련된 중요한 물질에 대해 개별적이 아닌 통합적으로 분석하여 생명현상을 연구하는 학문

윤성호 교수는 “이 연구성과는 바이오산업에 유용한 산업 대장균의 생체 정보를 확보한 것이다. 앞으로 유전체 조작을 통한 다양한 바이오제품의 생산균주 개발에 필수적인 정보와 기술에 기여할 것으로 기대된다.”고 연구의 의의를 밝혔다.

이 연구성과는 미래창조과학부‧한국연구재단의 기후변화대응기술개발사업과 농림축산식품부‧농림수산식품기술기획평가원의 포스트게놈다부처유전체사업의 지원을 받아 수행되었다. 뉴클레익 액시드 리서치(Nucleic Acids Research)에 3월 31일 게재되었다.


논문의 주요 내용

□ 논문명, 저자정보

   - 논문명 : Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3)

   - 저자 정보 : 윤성호 교수 (교신저자, 건국대), 김신연 박사 (제1저자, 건국대), 정해영 박사 (제2저자, 한국생명공학연구원), 김은연 교수 (제3저자, 한밭대), 김지현 교수 (제4저자, 연세대), 이상엽 교수 (제5저자, KAIST)

□ 논문의 주요 내용

1. 연구의 필요성
 ○산업 대장균 BL21(DE3)(Escherichia coli BL21(DE3))는 다양한 의약용 단백질과 바이오리파이너리 제품 생산에 널리 사용되고 있다. 연구진에 의해 2009년 유전체 염기서열 및 주석화가 이루어진 이후 유전체 분석이 이루어지지 않았다.
 ○유전체 내 포함된 유전자 종류와 위치를 결정하는 것을 유전체 주석화(genome annotation)라 한다. 이는 해당 유기체의 과학적․산업적 연구에 가장 기본적으로 이용되는 정보이다. 이번 연구에서는 재주석화(re-annotation) 작업을 통해 유전체 내 모든 유전자의 설명 및 위치를 업데이트하였다. 또한, 전체 유전자 발현 데이터를 분석하여 실제로 발현되는 유전자에 대한 정보를 축적하고 신규 유전자를 발견하였다.  

2. 실험 내용 및 결과
 ○다양한 유전체 주석화 방법에서 얻어진 결과들을 통합·비교하여 유전체 주석화를 실시하는 방법을 고안하였다.
 ○다양한 생장조건에서의 유전체 발현 데이터(전사체,transcriptome)를 분석하여 유전자의 발현 위치를 실험적으로 검증하였다.
 ○유전체 및 전사체 데이터의 통합분석을 통해 산업 대장균 유전체 내 1) 유전자 및 mRNA 발현 위치를 결정하고, 2) 기능 미상의 유전자에 기능을 부여하였으며, 3) 신규 유전자 및 비번역(non-coding) RNA를 발견하였다.

3. 연구 성과
 ○대장균 BL21(DE3)에 대한 최신 유전체 재주석 정보와 전사체 맵은 시스템 모델링 및 기능적 유전체 분석을 위한 필수 자원으로 사용될 것이며 앞으로 산업계에서 균주의 성능을 더욱 향상 시키는데 적용 될 것이다.


연 구 결 과  개 요

 1. 연구배경
 ㅇ 최근 석유자원의 고갈과 석유화학제품의 사용에 따른 지구 환경오염 및 온난화에 대한 대안으로 친환경 녹색기술 개발의 필요성이 높아지고 있다. 다양한 바이오매스를 활용하여 바이오연료 등 바이오에너지 및 바이오화학제품을 생산하는 고효율 맞춤형 디자이너 미생물 바이오공장 개발을 위해서는 석유화학경제에서 바이오경제로 이행하는 견인차 역할을 할 시스템생물학과 합성생물학의 발전이 필수적이다.
      * 시스템생물학 : 세포, 조직, 신호전달체계 등 생물학적 시스템들 간의 관계 및 상호 작용을 연구   하고 이러한 정보의 통합을 통하여 생물학적 시스템의 작용을 이해하고자 하는 학문 분야. 컴퓨터 모의실험 혹은 가상실험을 이용하여 생명현상을 연구하거나 설계함으로써, 사이버 생명체인 가상세포 실험을 통하여 연구실에서 수행하는 실험과 동일한 결과를 얻을 수 있음.
 ㅇ 산업대장균인 Escherichia coli BL21(DE3)는 다양한 의약용 단백질과 바이오리파이너리 제품 생산에 널리 사용되고 있으나, 유전체 및 전사체 연구가 미비하여 유전체 조작을 통한 생산공정 연구에 제약이 있었다. 
 ㅇ 따라서 이번 연구에서는 산업 대장균의 유전체 및 전사체의 통합 정보를 확보함으로써 생체 네트워크 이해 및 맞춤형 유전체 설계를 통한 최적의 발효 및 생산 전략을 수립할 수 있는 전기를 마련하였다.

2. 연구내용
 ㅇ 유전체와 전사체의 통합분석을 통해 가장 최신의 대장균 BL21(DE3)의 유전체 주석정보를 제시하였다. 다양한 유전체 주석화 방법을 이용하여 유전체 내 존재하는 전체 유전자들의 위치 및 기능을 예측하였다. 백만개의 염기서열 단편이 찍혀있는 타일링 어레이 (tiling array)를 이용하여 다양한 배양조건에서 실제 RNA로 전사되는 유전체 위치와 RNA 양을 실험적으로 측정하였다.
 ㅇ 전사체맵 분석을 통해 유전체 전체길이의 76%에 해당하는 1,609개 전사단위(transcription unit)를 밝히고, 37 개의 신규 유전자와 66개의 신규 비번역(non-coding) RNA를 발견하였다.

 ㅇ 유전체와 전사체 데이터의 통합분석을 통한 유전체 주석화 과정을 효율적으로 수행할 수 있는 방법을 제시하였다.

3. 기대효과
 ㅇ 이 연구성과는 산업균주의 유전체 및 전사체의 최신 기능정보를 제공함으로써, 시스템 수준에서 대사 및 조절 네트워크를 재구성 할 뿐 아니라 더 나아가 맞춤형 세포공장 개발을 위한 청사진을 제시한다.
 ㅇ 이 연구에서 개발된 유전체 및 전사체 통합분석 기법은 다른 미생물의 유전체 분석에도 적용 가능하다.

★ 연구 이야기 ★

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

대장균 BL21(DE3)은 산업용 균주로서 바이오제품의 고효율 생산에 널리 이용되는 산업 미생물로 많이 사용되며 많은 전세계 연구진들이 고효율 생산을 위한 균주개발연구에 활발히 진행하고 있다. 이러한 균주개발에 대사와 생리 및 기능 정보의 부족으로 인하여 비효율적인 시행착오(trial and error) 방식에 의한 생물공정 최적화 연구가 주로 수행되어 왔으며, 대장균 BL21(DE3) 주석화가 완전하게 되지 않은 점, 고해상도 전사체 정보는 아직까지 미미한 상황이었다. 연구팀은 이 점에 주목하여 대장균 BL21(DE3)의 고해상도 전사체 구조를 기반으로 가장 최근의 대장균 BL21(DE3)의 유전체 주석을 제시하였다.
이 연구를 통해 생체부품목록을 확보한다면 맞춤형 유전체 설계를 통한 최적의 발효 및 생산균주를 개발할 수 있을 것이라 생각하여 연구를 시작하였다.

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

대장균 BL21(DE3)은 연구목적으로 많이 사용되고 최초로 균주 전사체 구조 기반으로 제시하기 때문에 고효율 생산 바이오 제품을 위한 생장으로서 가장 많이 사용하는 최소배지 MR과 복합배지 LB를 선정하였다. 여러 개의 자동화된 파이프라인들을 사용하여 밀접하게 관련된 E. coli K-12 균주의 유전체 주석과 비교하여 주석화하였다. 최소 및 복합 배지의 여러 생장으로부터 고해상도 타일링어레이 데이터를 분석하여 전사체 구조를 특성화하고 오픈리딩프레임에 대한 근거를 제공하였고, 대장균 BL21(DE3) 유전체 및 전사체 구조에 대한 새로운 통합 분석은 88개의 코딩 DNA서열(CDS)에 대한 번역 개시 부위의 교정을 주도하고 대부분의 유전자에 대한 최신 정보를 제공하였다. 또한, 새로운 37개의 유전자와 66개의 비번역(non-coding) RNA가 발견하였다.

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

전사체 분석을 위해 전체 RNA 추출방법에 대한 고민이 많았다. 여러 RNA 추출 방법이 이용되고 있으나, 각 방법마다 단점이 포함되어 있다. 예를 들어, 특정방법은 300 염기쌍 이하의 작은 RNA 추출이 어렵거나, 3000 염기쌍 이상의 RNA는 거의 추출이 되지 않았다. 따라서 정확한 전사체 분석을 위해서는 특정 RNA 종류에 편향되지 않고 100 염기쌍 이하의 작은 크기의 RNA도 포함되는 고품질의 전체 RNA 추출방법을 해결하였다. RNA씨퀀싱은 유전체 씨퀀스 정보가 없어도 전체 RNA로부터 전사체의 발현을 측정할 수 있는 방법이다. 단일염기 단위의 고해상도의 장점을 가지고 있으나 리보솜 RNA 제거, 역전사 과정, 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)과정 등 여러 단계를 거치기 때문에 원치않는 안티센스 가닥의 발현, 특정 RNA 편향 등의 문제점을 가지고 있다. 이를 해결하기 위해 고해상도의 타일링 어레이를 제작하였고, PCR 과정의 편향된 cDNA합성을 피하고자 추출된 전체 RNA를 직접 레이블링 함으로써 고품질의 데이터를 획득할 수 있었다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

기존의 유전자 주석화(genome annotation)가 유전체의 생물정보학적 분석으로만 이루어진 것과 비교해 이번 연구는 실험적으로 유전체의 발현정보를 추가하여 유전체와 전사체를 통합 분석하였다.
단순히 컴퓨터로 유전자의 종류와 위치를 결정하지 않고, 실험적으로 이를 증명함으로써 보다 정확한 유전체 주석이 이루어졌다.

유전체 및 전사체 통합분석 과정
(그림1) 유전체 및 전사체 통합분석 과정
① 여러 개의 유전체 주석화 방법에서 얻어진 결과를 통합 분석하고  ② 대장균 K-12 유전체 주석과 비교 분석함. ③ 다양한 배양조건에서 고해상도 타일링 어레이를 이용하여 전사체 데이터를 확보함. ④ 분석된 유전체 및 전사체 데이터를 통합 분석함. ⑤ 최종적으로 분석 결과를 검토함.

산업 대장균의 신규 유전자 규명 및 전사체맵 완성 과정
(그림2) 산업 대장균의 신규 유전자 규명 및 전사체맵 완성 과정
유전체 주석화 과정을 통해 예측한 유전자와 실제 유전자의 발현 데이터를 가시화하는 과정을 나타낸 그림.  (1) 유전체는 두 가닥의 DNA 사슬로 이루어져 있으며 정방향(위 패널) 및 역방향 (아래 패널) 가닥의 유전자는 각각 노란색과 오렌지색으로 표시함. (2) 검정색 막대는 실제 RNA로 발현된 유전체 위치를 나타냄.  (3) 점으로 이루어진 그래프는 여러 배양조건에서의 유전자 발현 강도를 나타냄. (4) 맨 위/아래의 색깔띠(heat map)는 배양조건에 따른 유전자의 상대적인 발현 강도를 나타냄. 녹색은 비교생장조건에 비해 유전자 발현이 낮은 것을, 빨간색은 높은 것을 표현함 (5) 이러한 유전체 및 전사체 통합분석을 통해 유전자 발현 위치를 결정하고, 신규 유전자 및 non-coding RNA를 찾아냄.

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