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나노 옷 입고 혈액 안에서 오래 사는 줄기세포 개발
생명과학 한국연구재단 (2017-03-20 10:26)

한국연구재단은 홍진기 교수(중앙대) 이은아 교수(경희대) 연구팀이 중간엽 줄기세포*가 혈액 속에서 오래 버틸 수 있도록 표면에 나노박막을 입혀 치료 효과를 높이는 방법을 개발했다고 밝혔다.
     * 중간엽 줄기세포 : 중간엽 줄기세포는 골수와 제대혈에서 채취하는 줄기세포의 하나로 다분화능이 있는 줄기세포 중 하나임. 지방, 골세포, 연골세포와 같은 중요한 세포계열로 분화할 수 있으며 뇌졸중, 심혈관 질환, 마비, 면역성 질환, 염증성 질환, 패혈증 등의 치료에 사용함.

대부분 줄기세포 치료는 혈관 내 주입을 통해 이뤄진다. 혈관 내부의 빠른 혈류 속도와 다양한 물질들로 줄기세포가 표적세포와 조직으로 가지 못하고 사멸하는 경우가 많아 치료 효과가 제한되었다. 기존에는 줄기세포를 여러 번 주입하여 한계를 보완하였다.

연구팀은 줄기세포 표면에 나노두께의 얇은 박막을 코팅하는 방법을 통해 혈액 안에서 안정성을 유지하여 생존율을 높인 줄기세포를 개발하였다. 나노 박막은 천연고분자*인 L-라이신(Poly-L-lysine, PLL)*, 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)*과 RGD 펩타이드*를 이용하여 제조했다.
     * 천연고분자 : 천연으로 존재 또는 생물에 의하여 만들어지는 고분자 물질로 합성고분자에 대응하는 용어
     * L-라이신(Poly-L-lysine) : 아미노산 중 하나인 라이신이 중합되어 제조한 고분자로 양전하를 가짐
     * 히알루론산(Hyaluronic acid) : 동물 등의 피부에 많이 존재하는 생체 합성 천연 물질이다. 수산화기(-OH)가 많기 때문에 친수성 물질이며, 동물 등의 피부에서 보습 작용의 역할을 하며 음전하를 가짐
     * RGD 펩타이드: 알기닌(R)-글리신(G)-아스파틱산(D)으로 이루어진 펩타이드 서열. 세포 부착 등의 역할을 하는 세포 표면 단백질인 인테그린과 결합하여 세포의 기능을 수행함

연구팀은 중간엽 줄기세포 표면에 직접 나노두께의 코팅을 하기 위해 층과층적층법(Layer-by-Layer self-assembly)*이라는 필름 제조 방법을 이용했다.
     * 층과층적층법 : 고분자 기반 다층 나노필름을 제작하는 방법으로 여러 가지 재료를 다양한 분자간의 인력을 통해서 다층으로 자기조립할 수 있음

이 연구 성과를 통해 제조 된 나노 옷을 입은 줄기세포는 사람의 정맥과 유사하게 제작된 인공 환경에서 아무런 처리를 하지 않은 줄기세포에 비해 24시간 후 31.6배, 48시간 후 28.5배 이상의 생존률을 보였다.

홍진기 교수는 “이 연구성과는 중간엽 줄기세포 주입치료의 한계인 세포 안정성을 나노박막 기술을 사용하여 증대시켰으며 이전보다 정확하게 표적에 도달하게 하였다. 이 나노박막은 어느 줄기세포에나 적용이 가능하므로 백혈병, 뇌졸중 등에 사용하는 줄기세포 치료에 기여할 것으로 기대된다”고 연구의 의의를 설명했다.

이 연구성과는 미래창조과학부한국연구재단의 바이오의료기술개발사업의 지원으로 수행되었다. 케미스트리 오브 머터리얼즈(Chemistry of Materials)에 3월 14일 게재되었다.


논문의 주요 내용

□ 논문명, 저자정보

   - 논문명 : Cytoprotective Self-assembeld RGD peptide Nanofilms for Surface Modification of Viable Mesenchymal Stem Cells

   - 저자 정보 : 홍진기 교수 (교신저자, 중앙대), 이은아 교수 (공동교신저자, 경희대), 최다희 (제1저자, 중앙대), 이환규 교수 (제2저자, 단국대), 김현범 박사 (제3저자, 경희대), 양미소 (제4저자, 중앙대), 허지웅 (제5저자, 중앙대), 원윤선 (제6저자, 경희대), 장승순 교수 (제7저자, 조지아공대), 박종국 박사 (제8저자, 한국원자력의학원), 손영숙 교수 (제9저자, 경희대)

□ 논문의 주요 내용

1. 연구의 필요성
 ○중간엽 줄기세포는 다양한 질병을 치료하는 데 있어서 여러 방식으로 사용되어 왔다. 치료목적으로 사용되는 줄기세포는 대부분 혈관 내로 주입하는 방식을 사용한다.  중간엽 줄기세포는 대부분의 세포가 살아남지 못하여 표적위치에 도달하지 못하는 것이 그 한계로 지적된다.
 ○중간엽 줄기세포는 부착형 세포로서 표면에 섬유모세포 형태로 부착되어 있을 때 안정된 세포이다. 이러한 세포를 바닥에서 떼어 수용액에 분산시킨 후 혈액 내에 주입되었을 때, (1) 매우 빠른 혈류로 인하여 전단변형력*(shear stress)이 생기게 되어 세포가  손상을 받고 (2) 부착할 곳이 없는 세포는 자가 사멸 신호를 유도하게 되어 생존률이 낮아지게 된다.
 ○따라서 중간엽 줄기세포의 혈액 내에서 안정성 증대와 표적 능력을 증대하기 위하여 세포 표면에 나노사이즈의 다층박막을 제조할 필요가 있다.
    * 전단변형력(Shear stress) : 물체에 공학적인 성질이나 외력이 작용하였을 때 외력이 작용하기 전의 상태로 유지하기 위해 생기는 그 전단력에 대항하는 물질의 응력.

2. 실험 내용 및 결과
 ○중간엽 줄기세포 표면에 다층박막을 제조한 후 세포의 부착이 되지 못하게 함과 동시에 혈류의 전단변형력(shear stress)를 부여하기 위하여 교반배양*을 진행하였을 때, 박막을 제조하지 않은 세포의 경우 하루만에 빠르게 사멸하는 것을 확인하였지만, 박막을 제조해준 경우 3배가량 세포 수가 증가하여 세포의 증식이 일어남을 확인하였다.
     * 교반배양: 배양용기 내에서 교반막대를 회전시키면서 세포를 부유상태로 배양하는 부유배양법.
 ○ RGD 펩타이드와 세포 표면 단백질인 인테그린과의 결합이 일어나 인테그린의 활성화가 일어나 세포의 증식 및 생존에 관여하는 유전자의 발현이 증가하였다. 이로 인하여 RGD 펩타이드가 포함된 다층박막의 경우 세포의 안정성이 유전자의 발현으로 인함을 알 수 있었다.
     * 인테그린 : 세포 표면에 존재하여 피브로넥틴, 콜라겐 등의 세포외 기질에 세포가 접착할 때 작용하는 수용체분자. 때로는 세포의 상호작용, 면역, 지혈 등에도 관여함.
 ○ 이렇게 다층박막을 제조한 후에도 줄기세포의 기능인 분화능(colony formation)을 여전히 유지하였다.
 ○ 마지막으로 줄기세포에 다층박막을 제조한 후 쥐의 꼬리 정맥혈관에 주입하였을 때 혈액 내에 더 많은 수의 줄기세포가 존재하였다. 또한 더 많은 세포가 표적위치에 타겟팅 됨을 형광이미지로 확인하였다.

3. 연구 성과
 ○이 연구성과는 그동안 중간엽 줄기세포를 이용한 다양한 모델 연구들의 한계점인 안정성, 표적능에 대한 문제를 해결하였다. 이를 통하여 중간엽 줄기세포를 치료목적으로 사용하는 데 있어서 더 효율적으로 사용할 수 있는 플랫폼을 제공하였다.
 ○기존 줄기세포 치료제의 돌파구를 제시하였다는 점뿐만 아니라 다양한 박막기술에 대한 응용을 통하여 바이오메디컬 전 분야에 적용가능한 방향성을 제시하였다는 점에서 개발된 기술의 범위가 비단 줄기세포 치료뿐만 아니라 전반적인 조직공학까지 크게 사용될 수 있다.


연 구 결 과  개 요

 1. 연구배경
 ㅇ 중간엽줄기세포를 이용한 이식술은 다양한 질병에서 널리 이용되고 있으며, 주로 암, 백혈벙, 뇌졸중, 면역 결핍증과 같은 난치성 질병들이 주를 이루고 있다. 줄기세포 이식술의 대부분은 혈관내로 단일세포들을 주입하는 방식이 대부분이며, 혈액 내로 주입된 줄기세포의 경우 다양한 물리, 생물적인 스트레스로 인하여 줄기세포의 자가 사멸이 불가피하다는 것이 기존 방식의 큰 단점이다.
 ㅇ 또한 기존 연구의 경우, 하이드로젤이나 껍질을 만들어 물리적으로 세포의 안정성을 증대시키는 연구가 주를 이루었지만 큰 사이즈의 하이드로젤의 경우, 내부에 있는 세포까지 영양분을 전달하는 것이 매우 어렵고, 껍질의 경우에도 세포 분열 등 기능을 방해할 수 있기 때문에 세포에 영향이 없는 상태에서 세포를 보호하는 것이 기존 연구의 한계점이다.
 ㅇ 따라서 본 연구에서는 고분자 및 펩타이드 기반의 다층박막을 세포 표면에 제조하여, 세포의 기능 및 줄기세포능(stemness)은 유지한 채 단일세포의 안정성을 확보하고, 실제 생체 내에서 오래 생존이 가능한 나노박막 플랫폼을 제공하였다.

2. 연구내용
 ㅇ PLL, HA, RGD펩타이드를 이용하여 모델 실험으로 다층박막을 제조하였을 때, 안정적으로 박막이 형성됨을 두께, 표면분석 등을 통하여 확인하였다.
 ㅇ 동역학적 시뮬레이션(molecular dynamic simulation)을 통해 세포막에서 박막이 형성됨을 확인하였으며, 매우 불규칙적이나 안정적으로 박막이 형성됨을 확인하였으며, 형광이미지를 통해서 실제적으로 중간엽 줄기세포 표면에 박막이 제조됨을 확인하였다.
 ㅇ 또한 세포에게 전단변형력(shear stress)을 부여하기 위해 교반배양 (65 RPM: 1분 동안의 회전 수)을 진행하였을 때, 높은 스트레스로 인하여 박막을 제조하지 않은 세포의 경우는 하루 만에 거의 대부분 세포가 사멸하였지만, 박막을 제조해 준 세포의 경우 세포의 분열이 일어나서 세포 수가 증가하고 안정적으로 생존하였다. 박막을 제조한 후 세포 생존 및 증식에 관여하는 유전자가 인테그린의 활성에 의해서 발현됨을 웨스턴 블롯분석(western blot)으로 확인하였다.
 ㅇ PLL과 HA는 세포외기질(Extracellular Matrix ,ECM)* 역할을 하여 줄기세포에 안정성을 부여한다. RGD 펩타이드는 인테그린*과 결합하여 세포의 생존과 증식에 관여하는 유전자가 발현될 수 있도록 돕는 역할을 한다.
    * 세포외기질 : 주로 동물의 구조적지지 등을 담당하는 조직. 세포 사이의 기질은 여러 세포들 사이의 공간을 채우는 기질. 다당류로 이루어진 겔과 단백질 섬유가 세포 사이에 채워져 있어 세포외기질의 완충 작용을 도움
    * 인테그린 : 세포 표면에 존재하여 피브로넥틴, 콜라겐 등의 세포외 기질에 세포가 접착할 때 작용하는 수용체분자. 때로는 세포의 상호작용, 면역, 지혈 등에도 관여함.
 ㅇ 또한 줄기세포에 박막을 제조하여도 세포의 기능, 분화능, 이동능 력은 잃지 않고 유지함을 통해 박막이 세포에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다.
 ㅇ 마지막으로 다층박막을 제조한 줄기세포를 쥐 정맥 주사를 통해 주입하였을 때, 최대 3일까지 혈관 내에 더 많은 세포가 살아있음을 확인하였으며, 표적능 또한 증가하여 더 많은 세포가 타겟조직에 모여있는 것을 확인하였다.

3. 기대효과
 ㅇ 이 연구성과는 기존 세포 보호 방식과 달리 세포의 기능에 전혀 영향을 미치지 않음과 동시에 물리학, 생물학적으로 세포를 보호할 수 있는 다층박막을 제공하였다는 점에서 추후 바이오메디컬 분야에서 다양하게 활용될 수 있는 가능성을 제시한다.
 ㅇ 기존 줄기세포 치료의 가장 큰 단점이었던 체내 세포 주입 후 세포 사멸 및 효율성을 증대할 수 있다는 점에서 비용, 노력 등의 많은 경제적, 사회적 손실을 막을 수 있다는 점에서 매우 가치있는 연구라고 할 수 있다.

★ 연구 이야기 ★

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

중간엽 줄기세포는 분화능을 이용한 세포치료를 위해 많은 전세계 연구진들이 연구를 활발히 진행하고 있었다. 이는 향후 많은 난치병을 치료할 줄기세포로 주목받았지만 개별 줄기세포는 예민하고 약하기 때문에 혈관주입을 기반으로 한 치료 효과를 갖는데 생체 내 안정성 문제로 실제 상용화에는 어려움이 있었다. 지금 현재도 많은 임상실험이 이루어지고 있지만 대부분 세포의 사멸은 어쩔 수 없고 살아남는 소수의 세포들이 역할을 해주기 바라는 식의 실험이 많다. 그러나 사람 줄기세포의 경우 그 수가 한정되어 있고, 건강한 세포들만이 실제 임상실험에 사용될 수 있기 때문에, 기 확보한 세포들의 안정성을 높이는 것은 매우 중요하다고 할 수 있다. 따라서 기능성 망토나 수트처럼 생체 내에서 외부 환경에 영향을 받는 줄기세포 표면에 안정성을 부여할 수 있는 나노 두께의 옷을 입히게 된다면 더 강하고 안정적인 세포를 가질 수 있어 거의 모든 줄기세포를 이용한 많은 연구진들의 훌륭한 연구를 상용화 할 수 있는 가능성을 획기적으로 높일 것으로 생각하였다. 세포가 입을 옷의 소재는 히알루론산(HA)와 같은 물질을 세포외기질(ECM) 물질을 사용한다면 좋을 것이라 생각하였고, 단일 물질보다는 다양한 기능성 물질을 적재적소에 이용할 수 있게 다층박막으로 만든다면 더 강한 옷이 될 수 있을 것이라 생각하여 실험을 시작하게 되었다.

□ 연구 전개 과정에 대한 소개

세포에게 강력하지만 유연하고, 안정감을 줄 수 있는 물질을 찾기 위하여 히알루론산 및 펩타이드와 같은 물질을 선정하였다. 두 물질 다 바이오분야에서 널리쓰이는 물질이기 때문에 선정하였으며, 세포를 물리적으로 안정화하는 것과 더불어 생물학적으로도 안정화를 시키기 위하여 세포 부착에 관여하는 인테그린에 대해서 공부하게 되었다. 인테그린은 RGD와 같은 서열과 결합하여 세포 안정화에 도움을 주는 단백질이기 때문에 RGD 펩타이드를 또 다른 옷의 원료 물질로 선정하였다. 결과적으로 이러한 영향들이 모두 세포에게 반영되어 실제로 생체 내에서도 더욱 더 안정하게 원하는 위치까지 이동할 수 있는 줄기세포를 얻을 수 있게 되었다. 또한 고분자 기반의 나노 박막이므로 신축성이 매우 높기 때문에 세포의 이동에 전혀 영향을 주지 않았으며, 줄기세포가 다른세포로 분화할 수 있는 성질 등의 기능적인 문제에서도 전혀 박막이 영향을 주지 않는 사실을 추가적으로 확인하게 되었다.

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

처음에 사용한 물질이었던 PLL 펩타이드는 양이온 고분자이므로, 일정 농도 이상 세포에 적용할 경우, 세포막과 매우 강하게 결합하여 세포 사멸을 일으키게 되는 원인이 되었다. 너무 높은 농도로 박막을 제조할 경우, 매우 심하게 세포의 사멸을 초래하였기 때문에 계속적으로 실패를 거듭하다가 다양한 분자량, 농도 등을 사용해 보면서 많은 시행착오를 거쳐 지금의 농도와 물질을 찾을 수 있게 되었다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

기존의 세포 안정성 증대 연구와 다르게 나노두께의 다층박막을 이용하여 개별 세포가 입을 수 있는 옷을 만들었다는 점에서 매우 독특한 도전이었다. 이 기능성 박막은 세포가 생체 내에서 받을 수 있는 많은 외부 힘으로부터 세포를 보호하고 세포 스스로가 안정하다고 느낄 수 있도록 화학적 신호를 전달하여 세포의 체내 안정성을 높인다. 기존 시도는 세포를 하이드로젤에 넣고 섞음으로서 주입가능한 세포를 만들었었는데 기존과는 전혀 다른 시도로 세포의 안정성을 높이고 표적지향성을 가지는 나노두께의 다층의 박막 (옷)을 만들었다는 점에서 기존과는 매우 다른 접근법이라 할 수 있다.

줄기세포 표면의 박막 코팅에 대한 이미지 모식도
(그림1) 줄기세포 표면의 박막 코팅에 대한 이미지 모식도.
세포 표면에 제조된 다층박막의 모식도(위쪽)와 기대할 수 있는 효과들에 대한 모식도(아래쪽). 박막을 코팅함에 따라 세포의 안정성 증대(왼쪽), 이동능 유지(가운데), 분화능 유지 및 조절(오른쪽)이 가능해짐을 알 수 있음.

줄기세포를 쥐의 정맥에 주입하고 세포 생존능 및 표적화 효능 확인
(그림2) 줄기세포를 쥐의 정맥에 주입하고 세포 생존능 및 표적화 효능 확인
줄기세포 표면에 다층박막을 제조한 후 쥐 꼬리 정맥주사(tail vein injection)를 통해 세포를 주입하였을 때, 나노 옷을 입은 세포들은 최대 3일 동안 혈액 내에 더 많은 수가 생존함을 확인하였고 이를 통해 쥐 허벅지 근육의 상처부위에 더 많이 이동할 수 있는 기회가 생겨 상처부위에 많은 수가 존재하게 됨을 확인하여 줄기세포 치료 효과 가능성이 높음을 확인하였음.

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본 기사는 네티즌에 의해 작성되었거나 기관에서 작성된 보도자료로, BRIC의 입장이 아님을 밝힙니다. 또한 내용 중 개인에게 중요하다고 생각되는 부분은 사실확인을 꼭 하시기 바랍니다. [기사 오류 신고하기]
 
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