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혈액과 타액 속 유전정보를 이용한 진단기술 개발 동향
혈액과 타액 속 유전정보를 이용한 진단기술 개발 동향 저자 황인성 (인솔㈜ 기업부설연구소)
등록일 2017.04.06
자료번호 BRIC VIEW 2017-T10
조회 5474  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
최근 의료 행위는 질병의 치료보다 조기진단이나 현장진단과 같은 체외진단을 통한 질병의 예방과 관리에 중점을 두고 있다. 특정 질병과 연관된 여러 가지 생체정보가 혈액이나 타액을 포함하는 일련의 체액에 존재하는 것으로 밝혀지면서 비교적 채취가 간편한 체액을 이용하는 체외진단 기술이 급속도로 발전하고 있다. 특히 획기적인 차세대 유전체 염기서열 분석법이 속속 개발되는 동안, 혈액과 타액에 존재하는 유전정보를 해석하는 여러 분석 방법이 제안되었고, 이를 이용한 다양한 진단기술이 개발되었다. 타액은 가장 얻기 쉬운 검체로써 이를 통해 얻어진 인간 유전체의 염기서열을 분석해 각종 질병의 발병을 예측하거나 맞춤형 제약/건강 정보를 제공하는 유전정보 서비스와 타액에서 발견되는 각종 핵산의 유전정보를 통해 질병을 간편하게 진단하는 기술들이 등장할 것으로 예상된다. 본 총설에서는 혈액과 타액 속 유전정보의 종류를 알아보고 이들의 형태에 따른 각종 체외진단 기술의 개발 동향과 전망을 다루고자 한다.
키워드: blood, saliva, cell-free DNA, extracellular RNA, genetic information, early diagnosis, precision medicine, point-of-care test, molecular diagnosis, in vitro diagnostics
분야: Biotechnology, Bioinformatics
목차

1. 서론
2. 본론
  2.1 혈류 순환 핵산(CNA)
   2.1.1 비세포성 DNA (cfDNA)
   2.1.2 메신저 RNA (mRNA)
   2.1.3 마이크로 RNA (miRNA)
   2.1.4 LncRNA와 circular RNA (circRNA)
  2.2 세포외소포체(EV)
  2.3 타액을 이용한 진단
3. 결론과 전망
4. 용어설명
5. 참고문헌


1. 서론

21세기 인류는 나노과학, 생명과학, 정보통신의 융합적인 발전으로 인해 생체의 유전체 정보를 쉽고 빠르게 얻을 수 있고, 이전에는 검출할 수 없었던 다량의 바이오마커를 체액에서 검출할 수 있는 시대를 살고 있다. 이처럼 진단 기술이 발전함에 따라 진단치료(theragnosis), 정밀의료(precision medicine), 현장진단(point-of-care test, POCT), 그리고 분자진단(molecular diagnosis)과 관련된 체외진단법(in vitro diagnostics, IVD) 관련 분야가 급속도로 발전하게 되었다. 자연적으로 의료 서비스는 치료(cure) 중심에서 관리(care)와 예방(prevention) 중심으로 이동하고 있으며, 예방을 위해 조기진단(early diagnosis)의 필요성이 대두되고 있다.

기존의 조직검사(tissue biopsy, 조직생검)는 침습형(invasive) 방법으로 발병한 후에야 검체를 확보할 수 있고, 검체 보관이 어려우며, 환자의 의료비 부담을 증가시키고, 검사 후유증으로 다른 질병이 유발될 가능성이 있다[1]. 또한 같은 종양의 다른 부위에서 나타나는 유전적 이질성(intratumoral heterogeneity)이나, 전이된 종양의 이질성(intermetastatic heterogeneity) 때문에 종양에 대한 정보가 제한적일 수밖에 없다[2]. 따라서, 저침습형(less-invasive) 또는 최소침습형인(minimally invasive) 체액검사(liquid biopsy, 체액생검)를 통해 조직검사의 부작용을 피하는 동시에 분자생물학적 종양 이질성(tumor heterogeneity)을 추적할 필요가 있다[3]. 특히 체액검사는 이미 발병한 환자의 치료 경과를 주기적으로 관찰하는데 유리하며, 발병하지 않은 잠재적 환자를 대상으로도 조기 진단이 가능하다는 장점이 있다.

전통적으로 조기진단은 최소침습형인 혈액검사를 통해 이루어지지만 최근 오줌이나 타액을 이용한 비침습형(non-invasive) 진단법이 새롭게 주목을 받고 있다. 혈액이나 타액에 포함된 다양한 바이오마커(biomarker, 생체표지)들 중 DNA나 RNA와 같은 분자를 검출하는 분자진단법을 통해 각종 감염질환, 종양, 유전질환을 검사할 수 있다. 혈액 속에는 엑소좀(exosome)/미세소포체 (microvesicle)와 같은 세포외소포체(extracellular vesicle, EV)[5]를 비롯해 비세포 DNA (cell-free DNA, cfDNA)[6], 세포외 RNA (exRNA: 마이크로 RNA (miRNA)[7, 8], 메신저 RNA (mRNA)[9], long noncoding RNA (lncRNA)[10]) 등 다양한 형태의 순환핵산(circulating nucleic acid, CNA)이 존재하는데(그림 1), cfDNA 중 암세포로부터 유래한 순환종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)는 순환종양세포(circulating tumor cells, CTCs)와 더불어 암의 조기진단과 예후 판별에 유용하게 이용되고 있다[6]. 특히 ctDNA가 검출된 환자라도 CTC가 검출되지 않는 경우가 많아 ctDNA의 중요성이 부각되고 있다. 또한 혈류에는 EBV, HPV, HBV 등 바이러스에서 유래한 CNA가 존재하기도 하는데, 바이러스 감염에 의한 각종 암의 발병과 연관되어 있다[11].

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그림 1. (a) 혈류 순환 핵산(NCA)과 세포외소포체(EV)의 기원과 전파에 의해 나타나는 다양한 현상들. (b) 세포외소포체의 생성 과정과 엑소좀이 운반하는 여러 가지 물질들[4]. (b) 세포외소포체를 비침습적 또는 최소침습적으로 얻을 수 있는 인체 부위 모식도.

2. 본론

2.1 혈류 순환 핵산(CNA)

2.1.1 비세포성 DNA (cfDNA)

Mandel과 Metais에 의해 1948년에 처음 보고[12]된 이후, cfDNA는 여러 의학 분야에서 임상적으로 활용되고 있다. 특히 산모의 혈액에서 발견되는 태아의 DNA를 이용해 태아의 성별을 감별하거나, 태아의 유전자 변이나 염색체수 이상(aneuploidy)(예, 다운증후군)을 알아낼 수 있다는 점에서 가까운 시기에 산전 검사의 표준으로 자리잡을 가능성도 있다. 하지만 태아의 질병유전자를 교정하는 실질적인 치료가 윤리적 문제로 불가능한 상황에서는 시장이 확대되는 데 한계가 있다.

대개의 경우 환자의 cfDNA 농도는 건강한 사람에 비해 높다. 암세포는 성장이 빠른 만큼 세포사멸(apoptosis)과 괴사(necrosis)가 많이 일어나는데, 이 과정에서 발생하는 대량의 cfDNA는 정상인처럼 대식세포에 의해 모두 제거되지 못하고 혈류로 유입되기 때문이다. 세포사멸 과정에서 발생한 cfDNA는 주로 180 base pair (bp)의 배수 크기로 존재하는데, 실제 대개의 cfDNA 크기가 180-200 bp인 것으로 보아 세포사멸이 cfDNA 발생의 주된 원인이라고 볼 수 있다. 종양과 관련된 ctDNA는 정상적인 cfDNA와 구별되어야 하는데, 그 농도비율이 매우 낮아(<1.0%) 전통적인 Sanger 시퀀싱이나 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing, NGS) 방법으로는 정확한 정량이 어렵지만 디지탈 PCR[13], beads, emulsion, amplification, and magnetics (BEAMing)[14, 15], tagged-amplicon deep sequencing (TAm-Seq)[16], pyrophosphorolysis-activated polymerization (PAP)[17] 등을 이용해 그 한계를 극복할 수 있다(그림 2).

종양의 규모(tumor burden)에 비례해 농도가 증감하는 ctDNA는 약 2시간이면 농도가 반감되기 때문에, 수 주에서 수 개월씩 지속되는 단백질 마커나 영상자료에 비해 가장 최근의 정보를 제공한다. 더욱이 ctDNA는 환자 개인의 특정 종양에 대한 정량적인 유전 정보를 제공하기 때문에, 종양절제 후 최소잔존질병(minimal residual disease)을 검출할 수도 있고[14], 유방암[18], 장암[19, 20]의 경우 종양의 사멸, 전이, 재발을 더 정확하게 추적하며, 다른 바이오마커나 영상분석에서 일어나는 분석 오류를 줄일 수 있는 장점도 있다.

암을 유발하는 돌연변이로는 흑색종(melanoma)의 BRAF V600E, 폐암의 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR) L858R, 유방암의 HER2/neu (ERBB2) 유전자 증폭 등이 잘 알려져 있다. EGFR은 폐암과 대장암(bowl cancer) 세포에서 과발현되는데, EGFR 억제용 항체인 gefitinib (Iressa®) 또는 erlotinib (Tarceva®)을 이용한 폐암치료 중 약 절반의 환자들에게서 약제 내성을 유발하는 T790M 2차 돌연변이가 발생하고 있다. 이처럼 EGFR의 790번째 아미노산인 트레오닌(T)이 메티오닌(M)으로 변하면 약제가 결합할 자리에 ATP가 대신 결합해 약제의 작용을 방해하게 된다. Cetuximab (Erbitux®)이나 panitumumab (Vectibix®)을 이용한 치료 중에는 다른 유전자(예, KRAS 또는 MET)에서 2차 돌연변이가 발생한다. 이 경우 조직검사와 더불어 체액검사를 통해 ctDNA를 검출하게 되면 암의 재발 시기와 정도를 예측할 수도 있다. EGFR의 돌연변이를 ctDNA로부터 검출하는 대표적인 방법들은 표 1에 정리되어 있다[21]. 신경아세포종(neuroblastoma) 또한 항암치료 후 약제 내성을 유발하는 ALK F1174L 2차 돌연변이가 발생한다[22]. 대장암(colorectal cancer)의 경우 ctDNA를 분석한 결과 100%의 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)로 BRAF V600E 돌연변이가 발견되었고, 92%의 민감도와 98%의 특이도로 KRAS에서 점돌연변이가 발견되기도 했다[23]. 이와 같은 추세로 볼 때, 앞으로 약제 내성과 관련된 또 다른 유전자 변이가 발견될 가능성이 있다는 점에서 cfDNA 분석의 중요성이 증가하고 있다.

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그림 2. (a) 디지탈 PCR. 수백만 개의 기름 방울(nl – pl) 안에 반응액과 최대 1개의 유전자를 가둔 후 PCR 반응을 일으키면 자연형과 돌연변이의 차이가 두드러진다[13]. © 2017 National Academy of Sciences. (b) BEAMing. 특정 염기서열(Tag 1, 2)로 표지된 프라이머(Primer 1, 2)로 사전 증폭된 유전자를 Tag 1으로 수식된 마이크로비드와 섞은 후 Tag 1과 2를 이용해 디지털 PCR로 증폭한 후, 목표 유전자를 인식하는 형광 표지된 Primer 3으로 증폭의 정도를 확인[15]. © 2017 Macmillan Publishers Ltd., part of Springer Nature. (c) TAm-Seq의 작동 원리. (i) 증폭하고자 하는 유전자(이 경우 TP53)를 200 bp 미만 크기의 여러 조각(amplicon)으로 겹치도록 프라이머를 제작한 후, (ii) PCR로 동시에 소량 증폭한다. 이 때 돌연변이(별표)를 지닌 부분도 함께 증폭된다. 소량 증폭된 산물을 주형(template)으로 삼아 다시 각각의 프라이머로 나눠서 단일(single-plex) PCR로 증폭한 후 각각의 프라이머에 특화된 염기서열 분석용 프라이머로 표지한 후 NGS로 특정 유전자의 돌연변이 정도를 측정할 수 있다[16]. © 2012, American Association for the Advancement of Science. (d) PAP의 작동 원리. (i) 특정 점돌연변이(이 경우 T→G)와 상보적으로 결합하지만 DNA 중합반응이 일어나지 않도록 3’-OH가 결손된 dideoxy CMP (ddCMP)를 포함하도록 프라이머를 제작한 후, (ii) pyrophosphate (PPi)가 있을 때 상보 결합을 하고 있는 ddNTP를 제거할 수 있는 DNA 중합효소의 특성을 이용해 T→G 돌연변이만 선택적으로 증폭[17]. © 2012 American Association for Cancer.

표 1. 폐암 관련 EGFR의 돌연변이를 ctDNA로부터 검출하는 대표적인 방법들[21].
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일부 위에서 언급된 종양유전자(예: KRAS, PI3KCA, EGFR, BRAF 등)에서 발견되는 점돌연변이(point mutation)나 결손(deletion) 외에도 유전자 증폭(amplification), 재배열(rearrangement), 메틸에이션(methylation), 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 변이[24], 염색체수 변이 등이 암환자의 체액에서 발견되고 있다. 유전자 재배열(예: ALK)이나 증폭(예: HER2/neu), 개체수 변이는 PARE (personalized analysis of rearranged ends)나 디지털 염색체분석(karyotyping)과 같은 NGS 기술로 체액에서 검출이 가능하다.

종양에서 발견되는 후성유전학적(epigenetic) 변이가 ctDNA에서도 발견됨에 따라, 메틸-BEAMing, 메틸화 특이적 PCR, 양자점(quantom-dot) 기반 형광공명에너지전달(FRET) 등의 기법이 혈장에서 추출된 cfDNA의 메틸화를 검출하는데 이용되고 있다. DNA 메틸화를 검출하는 다양한 전기화학적 검출법은 최신 발간된 총설에 잘 정리되어 있다[25](그림 3). 최근 결장(colon), 폐, 유방, 위, 자궁내막(endometrial) 등 다양한 종양 유래 ctDNA에서 발견되는 zinc finger proten 154 (ZFN154)의 CpG 과메틸화 현상은 암전반을 아우르는 표지로 사용될 수 있는 가능성이 높다고 할 수 있다[26]. 또한 DNA 메틸화는 발암 초기 단계에 많이 발견되기 때문에 암의 조기 발견에 유용한 도구가 될 수도 있다.

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그림 3. (a-c) 효소 증폭을 이용한 DNA 메틸화의 전기화학적 분석법. (a) 비메틸화 특이적인 절단효소로 처리한 후 순환전류법(CV)으로 메틸화와 비메틸화 DNA 사이의 차이를 구분[27]. © 2013 American Chemical Society (ACS). (b) 라이게이션 연쇄반응을 이용한 메틸레이션의 전기화학적 검출방법[28]. © 2014 Elsevier B.V. (c) 금전극 위에 고정된 DNA의 메틸화 정도에 따른 광전기화학적 구분[29]. © 2008 Royal Society of Chemistry (RSC). (d-e) DNA의 메틸화 정도가 클수록 그래핀 전극(d)[30]이나 금 전극(e)[31]에 더 잘 흡착하고 PCR 증폭이 덜 되는 특성을 이용해 전류의 차이를 주는 방법. © 2014 RSC & 2017 Elsevier B.V.

2.1.2 메신저 RNA (mRNAs)

1999년 최초로 혈류를 떠도는 종양 유래 mRNA가 악성 흑색종(melanoma) 환자의 혈장에 존재한다는 사실이 밝혀진 이후[32] 지금까지 쌓인 많은 연구 결과는 암환자의 혈류를 순환하는 mRNA가 특정 암과 연관이 있으며, 암의 진단과 예후에 적합한 바이오마커임을 보여주고 있다[9]. 혈액 속에는 많은 양의 RNA 분해 효소(RNase)가 있다는 사실에 비추어보면 어떤 식으로든 mRNA가 RNase로부터 보호되어야 하는데, 통상적으로 세포사멸 과정에서 발생하는 세포사멸체(apoptotic body)인 미세소포체(microvesicles) 속에 담겨져 보호된다. 하지만 소포체 밖에서도 microRNA처럼 자체적으로 안정한 구조를 이루는지는 아직 알려지지 않았다.

사례로는, 세포주기 조절 단백질 cyclin D1을 발현하는 CCND1 mRNA의 양을 측정해 유방암 치료제(Tamoxifen)에 대해 반응이 좋은지 나쁜지 구분한 경우가 있다[33]. 흑색종의 경우에도 SOCS1과 SOCS3 mRNA 양이 환자의 생존율과 관계가 있고, PEG-IFNα-2b로 치료할 때 ISG15 mRNA의 농도가 줄면 약제에 대한 반응성이 낮음을 알 수 있다[34]. 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 환자는 MUC1과 VEGF mRNA의 농도가 증가하면 생존율이 감소하는 것으로 알려져 있다[35]. 일반적으로 mRNA를 검출하기 위해서는 NGS 기법을 이용한 RNA-Seq가 이용되고 있다[36](그림 4).

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그림 4. 전형적인 RNA-seq 방법[36]. 분리된 RNA로부터 제작된 cDNA 라이브러리의 염기서열을 밝힌 후 지표 유전체와 비교해 발현 정도나 차이를 예측하거나 동형전사체(transcript isoform)를 밝히는 등 각종 분석이 가능하다[36].

2.1.3 마이크로 RNA (miRNA)

순환 miRNA는 종양의 단계, 환자의 예후 또는 치료 반응성을 알 수 있는 좋은 지표로 이용되고 있다. 이들은 메신저 RNA와 마찬가지로 미세소포체나 세포사멸체 또는 엑소좀 안에 주로 존재하지만, nucleophosmin 1이나 argonaute 2와 같은 RNA 결합 단백질과 결합해 RNase로부터 보호되고 있기도 하다. 비소세포 폐암 환자의 혈청에서는 종양의 초기 단계에도 연관 miRNA가 검출되었고[37], 혈장에서는 환자의 생존율과 상관관계가 있는 9가지의 miRNA가 검출되었다[38]. 여러 miRNA (예: miR-145, miR-155, miR-382, miR-451, miR-148b, miR-409-3p, miR-801)의 조합을 통해 정상인과 유방암 환자를 구분할 수 있고[39], miR-10b, miR-215, miR-299-5p, miR-41의 조합을 통해 유방암 환자 중 임파선과 골수 전이 위험이 높은 환자를 구분할 수 있다[40]. 특히, 비소세포 폐암 환자의 혈청과 혈장에서 발견된 miR-21은 췌장암, 위종양, 난소암, 혈구암, 전립선암 환자들에게서도 발견되었고, 유방암과 폐암에 대한 독립적인 예후인자(prognostic factor)로 알려지고 있다[40]. 마찬가지로, 확산성 거대 B-cell 임파선암(DLBCL), 유방암, 또는 폐암 환자의 혈액과, 방광암 환자의 오줌, 그리고 췌장암 환자의 췌장액에서는 miR-155의 농도가 증가하는 것으로 알려졌다[40].

검출 방법으로는 microarray, NGS, 단일 또는 다중 실시간 PCR (qRT-PCR), 상용 시약(예: PAXgene Blood RNA Tubes, Qiagen)을 이용한 침전 등이 이용되고 있다. 이 중 목표 miRNA를 증폭할 수 있는 qRT-PCR이 가장 많이 이용되고 있다. 어느 방법이든 검출 신호를 정규화(normalization)하는 게 가장 큰 쟁점인데, qRT-PCR의 경우 5S RNA, 18S RNA와 같이 비교적 농도가 일정하게 유지되는 살림(housekeeping) RNA를 기준으로 정규화를 진행한다. 하지만, 외부에서 알려진 농도의 miRNA를 넣어서 지표로 삼는 방법(spike in control)을 선호하기도 한다[41]. 엑소좀에 포함된 miRNA의 검출 방법은 아래 <2.5 세포외소포체> 부분을 참고하기 바란다.

2.1.4 LncRNA와 circular RNA (circRNA)

miRNA보다 더 긴 형태인 long non-coding RNA (lncRNA)는 miRNA와 마찬가지로 단백질 발현과 직접적인 관계가 없지만 DNA, 단백질, 그리고 다른 RNA와 상호 작용하면서 DNA의 전사, 세포내 운반, 염색체 리모델링에 관여하여 세포의 분열, 성장, 사멸, 그리고 종양진행(tumor progression)에 영향을 주는 것으로 알려져 있다[42]. 암과 관련된 lncRNA 논문 발표수는 최근 5년 간 급증해 miRNA 논문 발표수와 거의 동등해질 정도로 관심이 집중되고 있다. 그림 5는 암과 관련된 lncRNA의 사례를 보여주고 있다[10].

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그림 5. 암과 관련된 lncRNA의 일부. 붉은색은 농도가 증가하는 경우, 군청색은 감소하는 경우이다[10].



circRNA는 비교적 최근에 밝혀진 것으로 아직 그 기능이 제대로 밝혀지지 않았지만, 최근 생물정보학적 분석에 의하면 circRNA는 miRNA와 결합해 miRNA의 실질적 농도를 감소시킴으로써 miRNA의 역할을 억제할 것으로 예상되고 있다[43]. 상대적으로 길이가 짧은 circRNA를 검출하기 위해서는 RNA-Seq과 같은 NGS 기법도 쓰이지만, 고리가 만들어지는 접점을 인식하는 프로브(circular jucnction probe)를 이용하는 방법이 선호되고 있으며[44](그림 6), 상업적으로는 처음으로 Arraystar라는 회사가 Circular RNA Microarrays라는 제품에 도입했다.

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그림 6. CircRNA의 생성과정의 한 예와 검출에 사용되는 고리접점 프로브의 사용 예.



2.2 세포외소포체(EV)

암환자의 혈액에서 검출되는 엑소좀(30-100 nm)과 미세소포체(100 nm - 1 µm)는 암의 진행, 전이, 약제 반응의 지표가 되는 약 4,500여 종의 단백질, 지방질, 유전 정보(예: miRNA, mRNA, tRNA, rRNA, DNA)를 담고 있다(http://www.exocarta.org)(그림 1). 표 2는 엑소좀에서 가장 많이 존재하는 miRNA 일부를 발췌한 것이다[45]. DNA는 상대적으로 드물게 존재하는데, 췌장암 환자의 혈청에서 발견된 이중나선 유전체 DNA에서 KRASp53 유전자의 돌연변이가 발견된 사례가 있다[46]. 엑소좀은 세포로부터 분비되는데, 면역과 관계된 세포 사이의 정보교환이나 HIV 바이러스의 운반과 관련이 있다. 엔도좀으로부터 유래한 엑소좀과는 달리 미세소포체는 주로 사멸 과정에 있는 세포의 외막 일부가 떨어져 나와 생긴다. 학술적으로는 엑소좀과 정확하게 구분하지 않기도 하며, 기술적으로도 둘 사이를 구분하기는 어려운 상황이다. 세포외소포체는 매우 안정해서 혈액, 흉수(lung pleural effusion), 오줌, 침, 모유, 정액, 양수, 복수, 뇌척수 등 거의 모든 체액에서 발견되며[47, 48], CTC보다 높은 농도로 존재하기 때문에 조기 진단용 바이오마커로써 급부상하고 있다(표 3).

표 2. 엑소좀이 운반하는 암관련 핵산과 분리/검출법[45].
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표 3. 세포외소포체와 다른 순환 생체표지의 비교[48].
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표 4. 세포외소포체 정제 방법[48].
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세포외소포체를 분리/정제하는 방법은 표 4에 정리되어 있다. 초고속원심분리는 표준(gold standard)적인 방법이지만, 시간이 오래 걸리고(>4 h) 수율과 순도가 낮은 단점이 있다. 밀도구배를 이용한 원심분리는 동일한 밀도를 지니는 물질이 같은 밀도층에 모이는 현상을 이용하기 때문에 엑소좀에 대한 수율과 순도가 상대적으로 높지만 바이러스나 미세소포체와 구분이 어렵고 초고속원심분리법이 지니는 단점을 그대로 지니고 있다. 음파를 이용한 분리법은 크기를 기준으로 엑소좀을 다른 물질로부터 분리하는데, 음파의 형태를 조절해 분리하고자 하는 입자의 크기를 선택할 수 있다. 면역결합을 이용하면 엑소좀이나 미세소포체의 표면에 있는 특정 단백질을 이용해 분리할 수 있기 때문에 특정 단백질의 발현 정도에 따라 엑소좀이나 미세소포체를 구분할 수 있는 장점이 있다. 거의 모든 엑소좀 표면에 존재하는 CD63 단백질을 잡는 항체가 우선적으로 쓰이는데, 자성나노입자로 표지된 세포를 분리할 목적으로 개발된 magnetic activated cell sorting (MACS) 컬럼이나, 여러 형태의 미세유체칩의 표면을 항체로 수식해 활용할 수 있다. 나노전단법 (nanoshearing)은 미세유체 장비에 교류 전기수력학적(ac-EHD) 방법으로 전극 위의 수 나노미터에 해당하는 전기층에만 전기적 자극을 가해 나노스케일의 유체 흐름을 발생시킴으로써 특이적 면역결합을 높이고 상대적으로 약한 비특이적 결합은 줄이는 방법이다.

표 5. 세포외소포체 검출 방법[48].
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그림 7. 종양의 발달 단계에 따른 세포외소포체(EV)의 적당한 검출 방법[4].



종양의 단계별로 세포외소포체를 검출하는 대표적인 방법들은 그림 7과 표 5에 정리되어 있다. 나노입자 추적분석법(nanoparticle tracking analysis, NTA)은 광학현미경과 브라운 운동을 분석하는 프로그램을 이용해 세포외소포체를 크기별로 계수하는 방법이다. 역학 빛산란(dynamic light scattering, DLS)은 빛에 의한 산란을 이용해 세포외소포체의 크기를 알아내는 방법이다. 유세포분석법은 전통적으로 고효율로 세포를 분석하는 방법이기 때문에 300 nm 이상 큰 세포외소포체만 검출하는 데 사용될 수 있다는 단점이 있지만 표면에 있는 마커에 따라 엑소좀을 분리할 수 있는 장점이 있다. 홀로그래픽 영상법은 나노렌즈와 LED 광원을 이용해 입자의 산란을 측정할 수 있기 때문에 나노입자 추적분석법에 비해 장비의 크기를 줄일 수 있는 장점이 있다. 나노포어법은 기본적으로 쿨터계수법(Coulter counting)과 비슷하게 입자가 분리막의 구멍을 통과할 때 막으로 분리된 양쪽 용액에서 나타나는 전류의 변화를 통해 입자의 크기를 알아내는 방법이다. 이 방법은 DLS에 비해 매우 작은 입자가 적은 농도로 존재할 때에도 측정할 수 있고 전자현미경보다 개개의 입자를 더 빨리, 더 싸게, 고효율로 분석할 수 있는 장점이 있다. 자기공명법은 소형화된 NMR (µNMR)을 이용해 박테리아, 단백질, 소입자, 핵산 등을 검출하는 방법이다. 나노 크기의 엑소좀을 검출하기 위해서는 자성나노입자(MNP)로 엑소좀을 표지하고 농축시켜 MNP에서 나타나는 NMR 신호를 분석해야 한다. 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)은 나노 구조를 지니는 표면의 위(~200 nm)에서 엑소좀에 의해 나타나는 광학적 간섭현상을 관찰하는 방법으로서, 매우 적은 양의 시료(0.3 µl)만으로도 유의미한 차이를 검출할 수 있다. 최근 Hu group은 ephrin type-A 수용체(EphA2)에 대한 항체가 결합된 금나노입자와 나노막대를 이용해 나노플라스몬 증강 산란(nanoplasmon-enhanced scattering, nPES)을 유도함으로써 췌장암 환자의 엑소좀을 일반인의 엑소좀과 구분해 낼 수 있었다[50]. 측류면역검출법(lateral flow immunoassay, LFIA 또는 immunochromatography, IC)은 장비 크기가 작고 검출 시간이 짧아 현장진단에 유리하기 때문에 앞으로 발전 가능성이 가장 높은 방법 중의 하나라고 할 수 있다[49]. 이 외에 다양한 형태의 나노입자를 이용한 약 90여 가지 연구 사례[51]와 미세유체를 이용한 사례[4]는 각각의 방법론에 대한 총설을 참고하기 바란다.

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그림 8. (a) 압타머(aptamer)를 이용해 목표 DNA를 증폭시킨 후 SPR로 검출[52]. © 2016 Elsevier B.V. (b) HCR과 DNA 삼중결합을 이용해 발색반응을 증폭[53]. (c) DNA 프리즘으로 세 가지 서로 다른 DNA를 형광 검출[55]. © 2017 ACS. (d) DNA 이중가닥으로 된 사면체로 서로 다른 두 가지 miRNA를 검출[56]. © 2016 ACS.

이상에서 소개한 여러 핵산 검출법은 다양한 DNA 3차원 나노구조(DNA origami)를 이용한 핵산 검출법에도 적절히 이용될 수 있다. 최근의 예를 몇 가지만 들자면, 압타머(aptamer)를 이용해 증폭된 목표산물을 SPR을 이용해 검출하거나[52], 융합연쇄반응(hybridizaiton chain reaction, HCR)과 DNA 삼중결합을 이용해 발색을 증폭시키거나[53], DNA 이중나선으로 된 사면체(triangular-prism, TP)를 금전극 위에 방향성 있게 고정함으로써 miRNA가 결합했을 때 효소 작용으로 생성된 전자를 매우 민감하게 검출하거나[54], 한 개의 마이크로비드에 프리즘 모양의 DNA 모듈을 고정해 세 가지 서로 다른 DNA 조각을 형광검출하거나[55], 두 가지 다른 파장의 형광을 억제하는 형태로 DNA 사면체(TetrNano)를 제작한 후 miRNA가 결합했을 때 구조의 변화를 일으켜 형광을 내도록 해 miRNA-155와 miRNA-21을 동시에 검출한 경우[56]가 있다(그림 8).

이상에서 살펴본 바와 같이, 세포외소포체를 분리하고 검출하는 수많은 방법들이 개발되었지만 세포외소포체를 진단의학에 이용하려면 엑소좀과 미세소포체를 확실하게 구분할 수 있는 방법론이 정비되어야 하고, 종양 유래 엑소좀이 운반하는 여러 바이오마커의 다양성이 어떻게 조절되는지에 대한 이해가 선행되어야 한다. 그럼에도 불구하고, 다양한 첨단 분석법을 조합해 엑소좀 안에 있는 단백질, RNA, DNA 등과 엑소좀 표면에 있는 단백질 마커를 함께 분석하면 다양한 질병을 진단하고 예후를 판별하는데 도움이 되는 것은 분명하다.

2.3 타액을 이용한 진단

타액은 고통 없는 비침습적 방법으로 검체를 확보할 수 있고, 혈액에 비해 질병 전염성이 낮고 보관이 용이하며, 검체 수집 전문가가 필요하지 않아 자가진단이나 POCT에 적합하기 때문에 질병의 관찰이나 예방을 위한 조기진단에 이용될 수 있다. 타액 검진은 채혈에 어려움이 있는 주사공포증 환자, 혈우병 환자, 노인, 신생아, 또는 치료 경과를 관찰하기 위해 자주 검체를 채취해야 하는 환자들에게 특히 유용할 수 있다. 타액은 주로 귀밑샘(parotid gland), 턱밑샘(submandibular gland), 혀밑샘(sublingual gland)에서 분비되며 수백 개의 작은 침샘과 잇몸샘의 분비물이 일부 섞여 있다. 과거에 비해 유전자 분석과 바이오센서 기술이 비약적으로 발전함에 따라, 혈액에 비해 극히 적은 농도로 존재함에도 불구하고 여러 형태의 바이오마커(단백질, 유전자, 미생물)를 검출할 수 있게 되었고, 현재까지 여러 암 관련 마커들이 타액에서 관찰되고 있으며(표 6) 시간이 지나면서 그 수는 점점 증가하고 있다[57-60]. (타액에서 검출되는 noncoding RNA (miRNA, lncRNA 등)의 종류와 이들의 검출 방법에 대해서는 최근의 총설[61] 참조) 타액의 유전체를 분석해 개인 맞춤형 건강관리의 방향을 제시하는 서비스(예: OralDNA®, Affymetrix GeneChip®, GenoFIND™, 한국의 Genoplan®과 gene2meTM 등)나, 동물의 구강 상피세포를 통해 얻어진 유전체를 분석해 애완동물의 혈통과 건강상태를 진단해주는 서비스(Orivet, DNA Diagnostics Center 등)는 일반적인 NGS를 이용하고 있지만, POCT용 진단장비는 아직 걸음마 단계에 있다. 따라서 현재까지 타액이나 구강점막을 이용해 몇 가지 질병이나 감염, 중독의 여부를 판별하는 POCT 키트는 대부분 단백질이나 호르몬을 검출하고 있음을 알 수 있다(표 7). 그러나 MinION (Oxford Nanopore Technologies) 같은 POCT 유전체 분석기가 대중화 된다면 타액을 통한 유전체분석 사업이 빅데이타 사업과 맞물려 급속도로 확대될 것으로 예상된다.

표 6. 타액에서 발견되는 여러 암 관련 마커들[57-60].
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표 7. 미국의 상용 타액(구강점막) 검진 키트의 예.
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그림 9. EFIRM을 이용한 타액의 엑소좀과 핵산 마커 검출. (a) 엑소좀 표면의 CD63과 결합하는 자성 비드를 이용해 엑소좀을 분리하고 자석을 이용해 전극 위에 고정한 후 CSW 전기장을 가해 엑소좀을 깨서 mRNA를 추출하는 과정[63]. (b) 포획 프로브와 검출 프로브를 유전체와 결합시킬 때 특정 파형의 CSW 전기장을 가하면 목표 유전자 염기서열과 일치하는 경우에만 결합이 일어난다. 단백질의 경우에도 특정 파장의 CWS 전기장을 이용해 항체와 특이적인 결합을 유도할 수 있다. 이처럼 특이적 결합이 일어난 경우에만 효소면역반응을 통해 전극으로 전류가 흐르게 되고 PCR 과정을 생략할 수 있다[65]. © 2013 Elsevier B.V.

2009년 UCLA의 David Wong 그룹은 타액의 단백질(IL-8)과 핵산(IL-8 mRNA)을 전기화학적 방법으로 동시에 검출함으로써 타액만으로도 구강암 진단이 가능함을 보였다[62]. 그 후 이들은 타액의 엑소좀을 CD63 항체로 입혀진 자성 마이크로비드를 이용해 85% 정도의 수율로 분리한 다음, 자석으로 전극 위에 마이크로비드를 고정한 후 연속직각파형(continuous square wave, CSW)의 전기장을 가해 엑소좀을 쪼개 대부분의 엑소좀 안에 있는 mRNA (GAPDH)를 검출했다[63]. CSW는 포착용 핵산(capture probe)과 결합하는 유기물(pyrrole)을 금전극 위에 고분자 형태로 전착(electrodeposition)할 때 이용되고, 엑소좀을 깨는 데에도 이용되기 때문에 이들은 이 방법을 전기장 유도 해제 및 측정(electric field-induced release and measurement, EFIRM)이라고 명명했다(그림 9). 이 실험에서 특별히 주목해야 할 것은, 형광으로 표지된 CD63을 발현하는 폐암 세포주(H460-hCD63-GFP)를 쥐의 흉강에 주입(intrapleural injection)한 뒤 20일 후에 쥐의 타액과 혈청에서 거의 비슷한 양의 hCD63-GFP를 검출함으로써, 체내 엑소좀 질병 마커가 타액을 통해 분비되는 현상을 증명했다는 점이다. 췌장암세포주 Panc02를 쥐의 췌장에 주입한 체계적이고 독립적인 실험에서도 마찬가지의 결과를 얻었다[64]. 이후에 이들은 CSW 전기장을 가해 전도성 고분자와 포착용 핵산을 금전극 위에 고정해 폐암 환자의 타액에서 Exon19Del과 EGFR L858R 돌연변이를 검출했다[65]. 지금까지 소개한 EFIRM 방법 외에도, 연결 프로브(junction probe) DNA와 자성으로 통제되는 전기화학적 RNA 바이오센서를 이용해 구강암과 관련된 miRNA-200a를 고감도로 검출하거나[66], 전극 표면에 포착 DNA를 고정하지 않은 채 목표 DNA (ORAVO1)와 결합한 경우에만 전극에 전자를 전달하는 방식도 보고된 바 있다[67](그림 10).

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그림 10. (a) 목표 DNA의 절반과 HRP로 표지된 검출 DNA의 절반에 모두 상보결합하는 연결 프로브 DNA를 자성 비드 위에 고정해 포착 DNA로 활용한다. 전자기석으로 자성비드를 분리한 후 반응용액에 담가 산화환원 반응을 통해 전류를 관찰한다[66]. (b) Methylene blue (MB)로 표지된 포착 DNA가 목표 DNA와 상보결합하면 DNA 절단효소가 이중 가닥을 인식해 MB가 달린 부분을 잘라낸다. 이렇게 잘린 MB는 DNA가 흡착하지 못하도록 음전하로 충전된 indium tin oxide (ITO) 전극의 표면으로 쉽게 확산해 전자를 전달할 수 있다[67].

3. 결론과 전망

지금까지 혈액과 타액 속의 유전 정보를 이용한 진단기술에 대해 최신의 연구 결과를 중심으로 살펴보았다. 바이오센서 기술이 발전하면서 혈액과 타액 속의 유전 정보가 더 많이 발견되고 있고, 각종 질병과의 상관 관계도 조금씩 정립되어 가는 중이다. 특히, 지난 10년 동안 소리 없이 진행된 타액 속의 바이오마커를 이용한 진단기술 연구는 비약적인 발전을 보여주었다. 추가로 발견되는 혈액의 유전 정보는 이미 구축된 기반 의료 시설로 쉽게 편입될 수 있다는 장점이 있는 반면, (최소)침습적인 검체 확보에 드는 비용과 의료법 때문에 자가 검진이나 POCT로 발전하는 데에는 한계가 있다. 이에 반해 타액 검진은 완전한 비침습적인 방법으로서 POCT로 발전할 수 있는 무한한 가능성이 있다. 또한 NGS의 발달로 타액을 통해 얻어지는 개인의 유전체는 물론 각종 미생물의 유전체 분석이 가능해지면서, 개인 맞춤형 건강관리 서비스를 제공하거나 구강의 미생물을 통해 각종 질병을 진단할 수 있다는 장점이 있다. 다만, 혈액에 비해 각종 바이오마커의 종류가 적거나 유전체의 후성유전학적 성질이 다른 점, 그리고 농도가 현저히 낮은 데에서 오는 근본적인 한계를 지속적으로 극복해 나아가야 하는 과제를 안고 있다.

4. 용어 설명

• 진단치료(theragnosis): 치료(therapy or therapeutics)와 진단(diagnosis)을 동시에 수행하는 차세대 의약 기술. 예를 들어, 질병 부위에 특이적으로 결합하는 치료제가 질병의 위치와 경과까지 알려주는 방식.

• 정밀의료(precision medicine): 개인의 유전정보, 질병정보, 생활습관 등을 토대로 특정 질병의 발현 가능성과 특정 치료법의 효과를 예측해 개인에게 최적화된 진단이나 치료법(예: 항암치료제)을 적용하는 의료행위. 유전체 염기서열 분석기술, 인공지능, 빅데이터 기술의 발달로 등장. 2016년 8월 대통령 주재 과학기술전략회의에서 9개 ‘국가전략 프로젝트’ 중 하나로 선정됨.

• 현장진단(POCT): 병원 안과 밖에서 환자가 있는 장소에서 환자나 보호자에 의해 즉시 이루어지는 진단.

• 분자진단(molecular diagnosis): 질병의 감염 여부나 정도를 판단하기 위해 환자의 검체(혈액, 소변, 타액 등)로부터 분자생물학(molecular biology)적 기술을 이용해 감염원(균, 바이러스, 암 등)의 유전 정보를 담고 있는 유전자(DNA, RNA 등)를 검사하는 방법. 대표적으로 간염, 성매개 질환, 호흡기 질환, 자궁경부암, 패혈증, 돌연변이, 약제 내성, 뇌수막염, 치매 등을 검사할 수 있다.

• 체외진단법(IVD): 인체로부터 얻어진 검체(조직, 혈액, 소변, 대변, 타액 등)로부터 질병의 예방, 진단과 예후, 건강 상태 판정, 질병 치료효과 판정 등을 하는 방법. 기술적으로 총 8개의 세부 분야(면역화학적 진단, 자가혈당 측정, 현장진단, 분자진단, 혈액진단, 임상미생물학진단, 지혈진단, 조직진단)로 나눌 수 있다(68).

• 조기진단: 겉보기에 건강해 보이지만 질병을 지니고 있을 가능성이 있는 사람을 이른 시기에 판별해 질병의 악화를 미연에 방지하거나 치료율을 높이는 방법. 현장진단과 연계된 체외진단법의 발달과 함께 조기진단의 경우의 수도 증가하고 있다.

• 비세포 DNA (cfDNA): 세포 밖으로 나와 체액에 존재하는 DNA로 각종 질병의 상태를 반영하는 유전정보를 지니고 있다. 이 중 종양세포로부터 나온 cfDNA를 circulating tumor DNA (ctDNA)라 부른다.

• 체액검사 또는 체액생검(liquid biopsy): 최소침습적으로 얻어진 체액 속에 있는 여러 바이오마커(단백질, 지방, 핵산 등)를 이용해 암 등의 질병을 진단하거나 경과를 관찰하는 방법.

• 세포외 RNA (exRNA): 세포 밖으로 나와 체액에 존재하는 RNA로 각종 질병의 상태를 반영하는 유전정보를 지니고 있다. 이들의 정확한 역할은 아직 밝혀지지 않았지만 대체로 세포 사이의 신호전달을 통해 세포의 생리를 조절하는 것으로 여겨진다. Messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), long non-coding RNA (lncRNA) 등이 있으며, 엑소좀이나 미세소포체의 안에 담긴 형태로 세포 밖으로 분비되기도 한다.

• 종양 이질성(tumor heterogeneity): 종양을 구성하는 세포 사이나 동일한 단일 종양 세포 내에서 나타나는 각각의 고유한 세포의 모양, 대사, 성장, 전이, 유전자 발현 등이 지니는 다양한 특성. 이들 중 암의 재생이나 신생의 성질을 지닌 세포는 약제 내성을 유발하는 요인이기도 하며 대개 표적항암치료와 정밀의료의 대상이 된다.

• 후성유전학(epigenomics): 유전자의 발현과 유전체의 형태를 조절하는 히스톤 단백질과 유전체 자체에 나타나는 여러 가지 화학적 변화를 종합적으로 연구하는 학문.

5. 참고문헌

==> PDF 참조

본 자료는 BRIC-KOBIC "유전체 연구동향" 정보제공자 모집으로 작성되었습니다.
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황인성(2017). 혈액과 타액 속 유전정보를 이용한 진단기술 개발 동향. BRIC View 2017-T10. Available from http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=2712 (Apr 06, 2017)
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