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인체 메타게놈 정보생산 및 분석 기술 동향
인체 메타게놈 정보생산 및 분석 기술 동향 저자 김인겸 (경북대학교)
등록일 2017.03.30
자료번호 BRIC VIEW 2017-T09
조회 1916  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
사람의 몸 세포는 약 10조개의 세포로 구성되어 있다. 이에 비해 장내에는 우리 몸 세포보다 10배 많은 약100조 마리의 미생물들(대부분 세균들)이 공생하고 있고, 구강, 피부, 비뇨생식기, 비강, 호흡기에 있는 미생물을 합치면 1000조 마리의 미생물이 공생하고 있다고 한다. 주요 인체 메타게놈 정보를 생산하는 방법으로는 DNA microarrays, 16S rRNA 유전자병렬식 서열분석법, shotgun sequencing이 있다. 이중 최근에 발달한 주요 차세대 염기서열분석 방법으로는 Pyrosequencing (GS FLX), 이온 반도체 서열분석법 (Ion Proton II), 합성에 의한 서열분석법 (Illumina MiSeq, HiSeq), 올리고핵산염 연결에 의한 서열분석법 (SOLiD), 단일 분자 실시간 서열분석 (Sequel System)이 있다. 인체 메타게놈 연구 기구로는 국제 인체 미생물 무리 연구 협의체, 미국립보건원 인체 미생물 분석 사업, 인체장관 메타유전체 연구단, The Ribosomal Database Project 등이 있다. 지금도 새로운 분석방법이 연구되고 있어서 향후 메타유전체 염기서열분석 기술은 더욱 발전할 것이며, 분석 단가는 더욱 저렴해질 것이다.
키워드: 메타게놈, 장내세균무리, 16S rRNA, DNA microarray, 병렬식 염기서열분석법, shotgun 염기서열분석법
분야: Biotechnology, Genomics
목차

1. 서론
2. 인체 메타게놈 정보생산 기술
  2.1 DNA microarrays
  2.2 16S rRNA 유전자 병렬식 서열분석법
  2.3 Random Shotgun Sequencing
3. 국내외 인체 메타게놈 분석 회사
  3.1 천랩
  3.2 마크로젠
  3.3 Second Genome Solutions
4. 인체 메타게놈 연구 기구
  4.1 International Human Microbiome Consortium
  4.2 Human Microbiome Project
  4.3 Metagenomics of the Human Intestinal Tract (MetaHIT)
  4.4 The Ribosomal Database Project (RDP)
5. 결론
6. 참고문헌


1. 서론

사람의 몸 세포는 약 10조개의 세포로 구성되어 있다. 이에 비해 장내에는 우리 몸 세포보다 10배 많은 약100조 마리의 미생물들(대부분 세균들)이 공생하고 있다. 사람의 유전자가 2만여 종인데 비해, 장내 미생물의 유전자는 이보다 150배 많은 약 330만여 종이나 된다. 위장관 뿐만 아니라 구강, 피부, 비뇨생식기, 호흡기 등에도 많은 미생물이 공생하고 있다. 사람의 유전자와 우리 몸에서 공생하는 모든 미생물 전체 유전자를 ‘인체 메타게놈’이라고 한다.

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장내 세균 무리는 7개의 문(phyla)으로 분류되는데, Firmicutes가 가장 많고, 그 다음이 Bacteroidetes이다. 약 90%의 장내 세균 무리는 이 두 가지에 속한다. 나머지 10%의 균들이 Proteobacteria, Fusobacteria, Verrucomicrobia, Cyanobacteria, Actinobacteria 문에 속한다.

세균들은 70S 리보좀에서 단백질을 합성한다. 70S 리보좀은 50S 리보좀과 30S 리보좀으로 나누어진다. 50S 리보좀에는 23S rRNA와 5S rRNA가, 30S 리보좀에는 16S rRNA가 있는데, 이들 rRNA 유전자들은 진화적으로 아주 잘 보전되어 있다. 이 중 16S rRNA 유전자의 염기 서열을 분석하여 미생물의 계통을 분류한다.

표 1. 인체 메타게놈 정보생산 기술 요약표
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2. 인체 메타게놈 정보생산 기술

세균의 유전 정보를 생산하는 방법으로는 정량적 중합효소연쇄반응법(qPCR), 변성/온도 구배 젤전기영동(Denaturing/ temperature gradient gel electrophoresis, DGGE/TGGE), 말단 제한절편길이 다형태(terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP), 형광 제자리 부합법(fluorescence in situ hybridization, FISH), Sanger 서열분석법, DNA microarrays, 16S rRNA 유전자 병렬식 염기서열분석법, shotgun sequencing이 있다[1]. 이 중 마지막 세가지 방법 즉, DNA microarrays, 16S rRNA 유전자 병렬식 서열분석법, shotgun sequencing이 인체 메타게놈 정보를 생산하는 방법이다.

2.1 DNA microarrays

시료 핵산에 형광을 표지한 후, 유리판에 고정된 상보적 핵산과 반응시킨다. 레이저 스캐너를 사용하여 형광을 정량적으로 읽는다. 검체로부터 분리한 전체 DNA, 또는 16S rRNA 유전자를 포함하는 증폭된 DNA를 사용하여 미생물을 분류학적으로 빠르게 반정량할 수 있다. 단점은 상보성이 다소 떨어져도 위양성 반응을 보일 수 있다. 현재 상업적으로 구입할 수 있는 제품으로는 human intestinal tract chip (HITChip™; Agilent Technologies Inc.), PhyloChip™ (Affymetrix), human gut chip (HuG Chip™) 등이 있다[3]. HuG Chip™은 66과(family)의 세균을 정량할 수 있다.

표 2. DNA microarrays 를 이용한 인체메타게놈 분석법.
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2.2 16S rRNA 유전자 병렬식 서열분석법

16S rRNA 유전자를 증폭 후 대량으로 병렬식으로 서열을 분석한다. 장점으로는 미생물 분류 가능하고, 빠르고 정량적이다. 또한 알려지지 않은 미생물도 검사 가능하다. 단점은 시간이 많이 걸리고, 비용이 비싸다. 현재 상업적으로 구입할 수 있는 제품으로는 Genome Sequencer FLX® (Roche Diagnostics), Illumina® MiSeq, Ion PGM/Proton™ (Thermo Fisher Scientific), SOLiD™ (Thermo Fisher Scientific)등이 있다.

Pyrosequencing은 1회 분석 시 5억개의 염기 서열을 99% 정확도로 분석한다. 이 속도는 Sanger 서열분석법보다 2천배 빠른 속도이다. 두 군을 비교할 때, 예를 들면 마른 체형과 비만 체형의 메타게놈을 분석할 때 유용하다. 454 Sequencing에 기반을 둔Genome Sequencer FLX (GS FLX) System은 High-Throughput sequencing 기술 중 유일하게 Long Read를 보유하고 있으며 높은 정확도를 지니고 있다. 따라서 비용 절감과 완성도 측면에서 가장 뛰어난 결과를 낼 수 있는 기술이다. 한편 이온 반도체 서열분석법은 DNA 중합 시 발생하는 수소이온을 정량함으로써 서열을 분석한다. 일명 Ion Torrent 서열분석법, pH 매개 서열분석법, silicon 서열 분석법, 반도체 서열분석법이라고도 불린다. Pyrosequencing과 이온 반도체 서열분석법의 공통적인 단점은 단일염기가 6개 이상 반복될 때 오차 발생이 높아진다는 것이다.

합성에 의한 서열분석법은 Illumina에서 MiniSeq과 NextSeq (75-300 bp), MiSeq (50-600 bp), HiSeq 2500 (50-500 bp), HiSeq 3/4000 (50-300 bp), HiSeq X (300 bp) 등 다양한 기종을 개발하였다.

SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) 분석법은 글자 그대로 올리고핵산염을 연결시키면서 서열을 읽는다. 분석 시간이 많이 걸리지만, 분석 단가가 저렴하다. 차세대 시퀀싱 기술 중 가장 진보된 3세대 기술인 단일 분자 실시간 서열분석(single-molecular real-time sequencing) 방법은 고속 염기서열분석 방법 중에서 염기 절편을 가장 길게 읽을 수 있다. 최근에 서울대 서정선 교수님팀에서 이 방법을 이용하여 한국인 표준 유전체에 대한 논문을 발표하였다[2].

표 3. 차세대 고속 염기서열 분석법.
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2.3 Random Shotgun Sequencing

메타게놈 전체를 임의의 조각으로 자른 다음, 대량으로 병렬식으로 염기서열을 분석한다. 염기 서열이 밝혀진 임의의 조각들을 짜맞춤으로써 전체를 재구성한다. 장점으로는 미생물 분류 가능하고, 빠르고 정량적이다. 세균 무리를 유전적 다양성뿐만 아니라 기능적으로도 분류할 수 있기 때문에, 분석 결과를 보고 건강한지 병이 있는 지도 짐작할 수 있다. 단점은 비용이 비싸고, 생물정보학적 분석 작업이 필요하다. 따라서 통상의 실험실에서 분석하기는 쉽지 않다. 미국 국립보건원에서 지원하는 Human Microbiome Project는 이 방법으로 염기서열을 분석했다.

3. 국내외 인체 메타게놈 분석 회사

3.1 천랩

CLcommunityTM은 천랩(http://www.chunlab.com)에서 개발한 메타게놈 분석 프로그램이다. 세균 및 곰팡이를 포함하는 미생물 군집의 특성을 이해하기 쉽도록 연구자들이 다양한 그래프 및 그림으로 시각화할 수 있다. CLcommunityTM를 사용하면 차세대 염기서열 분석(NGS) 플랫폼(Roche 454 pyrosequencing technology or Illumina polony sequencing technology)에 의해 생성된 16S rRNA 유전자 시퀀스 또는, 곰팡이의 경우 ITS (Internal transcribed space) 시퀀스를 분석할 수 있다. 유전자 증폭(PCR) 시 universal primer를 사용하여 광범위한 taxonomic group들을 대상으로 다양한 유형의 amplicon을 만들 수 있다. NGS를 이용하여 이 amplicon을 분석할 수 있다. 하나의 샘플에서 생성된 대량의 16S rRNA 유전자 염기서열들은 생물정보학 분석 파이프라인과 통계학적인 분석을 거쳐서, raw sequence data 와 함께 확장자 clc인 (*.clc) 천랩 고유의 파일 안에 저장된다. 사용자는 CLcommunityTM 프로그램을 사용하여 여러 개의 clc (*.clc) 파일을 열어 다른 군집들과 비교하거나 다양한 통계분석을 수행할 수 있다. 기존에 보유하고 있는 NGS 데이터를 clc (*.clc) 파일로 전환하여 CLcommunityTM 프로그램으로 분석할 수도 있다.

CLgenomics™은 미생물 유전체를 쉽게 분석할 수 있도록 천랩에서 개발한 응용프로그램 이다. 유전자와 유전체들의 특성을 쉽게 파악할 수 있다. 생물정보학에 대한 전문지식이 없는 연구자들도 사용할 수 있다.

3.2 마크로젠

마크로젠(http://www.macrogen.co.kr)은 454 Sequencing에 기반을 둔 Genome Sequencer FLX시스템으로 16S rRNA유전자를 분석한 후, Global alignment, Taxonomic assignment 표준 분석을 서비스한다. 메타유전체간 비교 분석 서비스도 가능하다.

Shotgun sequence을 하면 de novo assembly, Blastx 표준 분석이 가능하며, 유전자 예측, OTU counting, 후보 유전자의 기능 예측, 대사경로 설정, 두 가지 이상 샘플에 대한 통계적 분석도 가능하다.

3.3 Second Genome Solutions

Second Genome Solutions (http://www.secondgenome.com)은 인체 메타게놈 정보생산 기술 전문 서비스회사이다. 즉, DNA microarrays, 16S rRNA 유전자병렬식 서열분석법, shotgun sequencing을 모두 서비스한다. 이 외에도 메타전사체(Metatranscriptome) 프로파일링 서비스도 제공한다.

DNA microarrays는 Lawrence Berkeley National Lab에서 개발한 PhyloChip™ 을 기술 이전하여 서비스한다. 16S rRNA 유전자 병렬식 서열분석법은 Illumina MiSeq® 서열분석법을 서비스하고 있다. shotgun sequencing 후에는 Taxonomic Annotation (Greengenes™ database), Functional Annotation, Pathway Annotation (MetaCyc)를 서비스한다.

4. 인체 메타게놈 연구 기구

4.1 International Human Microbiome Consortium

International Human Microbiome Consortium(국제 인체 미생물 무리 연구 협의체)은 2008년 10월 Heidelberg 국제회의에서 공식적으로 발기되었다. 인체 미생물 무리를 연구하는 대규모 사업단이나 연구비를 지원하는 연구재단을 협의체 회원으로 두고 있다. 한국연구재단과 한국생명공학연구원, 미국 국립보건원, 유럽 위원회, 캐나다 보건연구소, 일본 문부과학성 등 세계 유수의 연구지원기관과 연구소가 정식 회원이다.

주요 연구 프로그램으로는 프랑스가 주축이 된 MetaGenoPolis (2012-2019), International Human Microbiome Standards (2011-2015), 서울대학교 고광표 교수가 연구책임자인 Korean Microbiome Diversity Using Korean Twin Cohort Project (2010-2015), 미국 국립보건원에서 지원하는 Human Microbiome Project (2008-2013), 호주 정부에서 지원하는 The Australian Jumpstart Human Microbiome Project (2009- ), 캐나다 정부가 지원하는 Canadian Human Microbiome Initiative (2009- ), 유럽 위원회에서 지원하는 MetaHIT (Metagenomics of the Human Intestinal Tract, 2008-2011) 등이 있다. 제7회 IHMC 국제회의가 2018년 아일랜드 Cork 대학 주관으로 개최될 예정이다.

4.2 Human Microbiome Project

Human Microbiome Project (HMP; 인체 미생물 분석 사업)는 건강 또는 질환과 관련된 미생물을 동정하고 특성을 연구하기 위해, 미국 국립보건원 5개년 기획사업으로 2008년 시작했다. 이 사업은 신체의 주요 부위 즉, 구강, 피부, 질, 장관, 비강/폐 등 다섯 곳에 서식하는 약 3천여 종의 세균 유전체 염기 서열을 분석할 계획이다. 또한 세균의 16S rRNA 서열도 PCR 증폭 후 정밀 분석하기로 했다.

242명의 건강한 미국인이 이 사업에 참여하여, 남자는 각각 15 샘플, 여자는 각각 18샘플을 채취했다. 약 5천 샘플의 시료를 분석하여 인체에는 약 만 종 이상의 미생물이 서식하는 것을 밝혔다.

전체 예산 1억 15백만 달러를 투입하였으나, 아직까지 질환과 관련된 미생물을 동정하고 특성을 밝히려는 처음의 목표에는 도달하지 못했다. 주요 임상적 결과로는 임신을 하면 질 내 미생물의 다양성은 줄어들고, 불명열이 있는 어린이는 비강에 바이러스가 증가한다 것 정도이다.

4.3 Metagenomics of the Human Intestinal Tract (MetaHIT)

Metagenomics of the Human Intestinal Tract (MetaHIT; 인체장관 메타유전체 연구단)는 프랑스 연구자들이 주축이 되고 덴마크, 독일, 스페인, 이탈리아, 네덜란드, 영국, 중국 연구자들이 참여했다. 2008년 1월부터 4년 반 동안 2천만 유로 이상을 투입하여 124명의 대변 샘플에서 540Gb의 유전 정보를 얻었다. 주요 연구 결과로는 292명의 덴마크인을 대상으로 한 비만 연구에서 미생물이 비만 발생에도 영향을 미친다는 것을 밝혔다. 장내 미생물 유전자 량에 따라 장 상피세포를 3종류로 분류했다. 장내 미생물 유전자가 적은 사람들은 Bacteroides, Rumnicoccus gnavus가 많은 제1형 장 상피세포를 가지고 있으며, 염증성 장질환, 제2형 당뇨병, 허혈성 심장 질환이 잘 생긴다. 반면, 장내 미생물 유전자가 많은 사람들은 Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia inulinivorans가 많은 제3형 장 상피세포를 가지고 있고 염증이 적다.

4.4 The Ribosomal Database Project (RDP)

1980년대 후반에 일리노이 대학교의 Carl R. Woese 박사와 Gary J. Olsen박사는 세균 16S rRNA가 세균마다 잘 보전되어 있어서 세균 분류에 사용할 수 있다고 제안했다. 1989년 미국 국립과학재단으로부터 연구비를 지원받아 세균 16S rRNA 서열 정보를 데이터베이스로 구축하고, 1992년 1월 5일자로 RDP(http://rdp.cme.msu.edu) 1.0판을 공시했다. 471개의 세균 16S rRNA 서열과 165개의 곰팡이 28S rRNA 서열을 포함하고 있다.

2013년 7월 18일자로 RDP11.1판이 공시된 후, 3년 후인 2016년 9월 30일자로 RDP 11.5판이 공시되었다. 여기에는 3,356,809개의 세균 16S rRNA 서열과 125,525개의 곰팡이 28S rRNA 서열을 포함하고 있다.

5. 결론

최근 연구에 의하면 사람의 장내 세균 무리는 체지방, 당뇨, 고지혈증, 성장, 면역조절, 감염병 예방 등에 결정적 영향을 미칠 뿐만 아니라, 신생아기에 어떤 인체 공생세균들이 형성되는지에 따라 아이의 성격과 지능 발달에도 커다란 영향을 미친다는 사실이 속속 규명되고 있다. 이러한 이유 때문에 최근 학계에서는 인체 세균 무리를 사람과 공생관계에 있는 미생물로 보는 시각에서 벗어나, 인체 세균 무리를 장기의 하나로 인식하기 시작하면서 “잊힌 장기(forgotten organ)"라고 부르기도 한다. 인체 세균 무리와 질병과의 상관관계 규명을 위해서 메타유전체 염기서열분석은 필수적이다. 향후 메타유전체 염기서열분석 기술은 더욱 발전할 것이며, 분석 단가는 더욱 저렴해질 것이다.

6. 참고문헌

==> PDF 참조

본 자료는 BRIC-KOBIC "유전체 연구동향" 정보제공자 모집으로 작성되었습니다.
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김인겸(2017). 인체 메타게놈 정보생산 및 분석 기술 동향. BRIC View 2017-T09. Available from http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=2706 (Mar 30, 2017)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
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