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간(liver)을 넘어서: siRNA 치료제 표적 전달 분야의 진척상황과 도전과제
간(liver)을 넘어서: siRNA 치료제 표적 전달 분야의 진척상황과 도전과제 저자 박근우 (충남대학교 의학전문대학원)
등록일 2017.02.28
자료번호 BRIC VIEW 2017-R06
조회 2352  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
치료적 관점에서의 유전자 침묵(gene silencing)기법은 약물의 목표가 될 수 있는 대상의 확장, 희귀질병 치료가능성 등, 약물요법의 획기적인 진보를 가져올 수 있다. 다양한 기술적 한계들이 올리고뉴클레오티드 치료제의 효율적인 사용을 어렵게 만들고 있고, siRNA 치료제는 약동학적 특성과 세포 내 능동적인 흡수가 불충분한 실정이다. 전달방법의 치열한 개발과 진화로, 간 조직 세포에 우세한 효율적 흡수가 가능하게 됐는데, 사실상 모든 나노입자와 리포좀(liposome)을 기반으로 한 약물 전달방법은 간 조직에서 가장 높은 축적을 보인다. 가장 효과적인 전달 전략으로는 N-acetylgalactosamine 생체접합체와, 리포좀을 이용한 방법이 있으며, 두 가지 방법 모두 간과 관련된 질환의 치료법으로 임상시험이 진행 중이다. 간을 제외한 조직이나 종양조직에 유전자 침묵 치료의 도입은 더욱 어렵다. 종양에 선택적인 약물전달을 위해서는 입자의 크기와 같은 물리적 특성의 세밀한 조절과, 특이적인 리간드 이용의 장점을 살리는 방법 등이 필요할 것이다. 원하는 장기조직으로의 충분한 축적과정 중에서 혈관내피세포, 세포막, 엔도좀(endosome)과 같은 중대한 장벽이 존재한다. 신경학적 질환에 대한 효율적인 올리고뉴클레오티드 치료를 도입하기 위해서, 혈액뇌장벽(blood-brain barrier)으로 보호되어 있는 뇌에 대해서는 특히 관심이 높다. 중추신경계에 대한 약물축적을 증가시키기 위해, 수용체 특이적인 결합을 통한 혈액뇌장벽의 트랜스사이토시스(transcytosis, 통과세포외 배출)가 연구되었다. 이 리뷰논문에서는 현재 siRNA 치료제의 임상적용 상태, 유망한 조직 또는 종양 특이적인 리간드를 사용하는 전임상 단계의 개념들을 요약하였다. 생체접합체와 리간드가 수식된 지질 또는 중합체 입자로서의 요건 및 각각의 장단점을 논의하였다.
키워드: RNA interference(RNA 간섭), siRNA, Delivery systems(전달 systems), Liposome(리포좀), Bioconjugates(생체접합체), Targeting
본 자료는 Going beyond the liver: Progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release, Volume 203, 10 April 2015, Pages 1-15의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목차

1. 서론 - 올리고뉴클레오티드 치료제(oligonucleotide therapeutics)
2. siRNA 치료제 - 간에 존재하는 표적에 대한 효율적인 억제
  2.1 생체 장벽 및 생체 내 분포(Barriers and biodistribution)
  2.2 세포 내 흡수 및 세포 내 움직임(Cellular uptake and intracellular trafficking)
  2.3 BBB 트랜스사이토시스(BBB transcytosis)를 위한 표적 및 리간드
  2.4 백혈구와 혈관내피세포에 대한 표적 및 리간드
  2.5 종양에 대한 표적 및 리간드
  2.6 나노입자 약물 전달 시스템
  2.7 표적지향 약물전달을 위한 생체접합체(Bioconjugate)
3. 결론


1. 서론

· 올리고뉴클레오티드 치료제(oligonucleotide therapeutics)

RNA 간섭(RNA interference, RNAi)의 개념을 이용한 치료방법은 매우 촉망받고 있다. 사람 유전체 데이터를 활용하여, mRNA 유전자 서열을 기반으로 한 올리고뉴클레오티드 치료제를 디자인할 수 있다. 표적 서열을 잘 정하면 각각의 모든 유전자들은 RNAi 작용기전을 통해서 억제될 수 있으며, 나아가 전사체, 돌연변이, 스플라이싱 변이체까지 구별하여 표적화할 수 있다. 전통적으로 활성이 있는 물질을 찾기 위해 복잡한 탐색과정이 필요했던 것과 대조적으로, 유전자의 기능에 기반하여 빠르고 쉬운 치료제의 개발이 가능하다.

올리고뉴클레오티드 치료제는 그들의 작용기전에 따라 다음과 같이 여러 가지로 분류된다: 안티센스(Antisense), 압타머(aptamer), 스플라이싱 교정 올리고뉴클레오티드(splice correcting oligonucleotide), siRNA, miRNA 유사체와 길항제, 면역활성조절물질(immunomodulating agent). 세포 내 RNAi 작용 복합체가 매우 효율적으로 작용하므로 siRNA와 miRNA 올리고뉴클레오티드가 치료제로써 가장 각광받고 있다. 일부 대비되는 생물학적 효과에도 불구하고, 치료제 개발의 측면에서 중요한 특징들은 모든 올리고뉴클레오티드 분류에서 공통적이다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 전통적인 작은 분자 약물에 비해서 상대적으로 큰 분자이다. 하지만 단클론 항체(monoclonal antibody)와 같은 대부분의 단백질 분자보다는 크기가 작다. 또한, 다중음이온성(polyanionic), 친수성(hydrophilic)의 성질로 인해서 생체 내 분포와 세포 내 흡수에 있어 부정적인 영향이 크다. 화학적 구조와 약학적 제제 또한 약동학적, 약력학적 특성에 본질적인 영향을 미친다.

전사과정에 작용하여 유전자 침묵(gene silencing)을 일으키는 올리고뉴클레오티드는 현재 치료가 불가능한 여러 가지 암, 바이러스감염, 자가면역질환, 심혈관계 질환 등에 새로운 양식의 치료법이 될 수 있다. 치료제로써의 가능성이 알려진 것은 수십 년이 지났지만 현재 단지 2가지의 올리고뉴클레오티드 치료제만이 시장에 나와있다. 또 한가지는 승인되었지만 더 이상 판매되지는 않는다. 최초로 허가를 받은 약은 fomivirsen으로, CMV 바이러스(cytomegalovirus) 감염을 치료하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 안내주사(intraocular injection)를 통해 국소적으로 적용된다. 효과적인 HIV 치료요법의 도입으로 인한 낮은 수요로 인해 fomivirsen은 더 이상 사용되지 않는다. Pegaptanib은 압타머로, 노화에 따른 황반변성(macular degeneration)의 국소 치료에 사용가능하며, VEGF(혈관내피성장인자, vascular endothelial growth factor)의 유해한 효과를 억제한다. Mipomersen은 안티센스 올리고뉴클레오티드로 2013년에 FDA 승인을 받았으며, 가족성 고콜레스테롤혈증(familiar hypercholesterolemia)의 치료에 사용한다. Mipomersen은 apolipoprotein B100(아포지질단백질 B100)의 발현을 억제하여 혈중 콜레스테롤, LDL-C, apolipoprotein B100의 레벨을 낮춘다. Mipomersen은 최초로 전신적으로 적용된 올리고뉴클레오티드로 대표되기도 한다. Mipomersen은 주로 간세포에서 작용하는데, 그 화학적 변형으로 인해 간 조직 내의 높은 축적이 가능하다. 혈장단백질과 강하게 결합함으로써 신장으로의 배출(신 배설, renal elimination)이 방지된다. Mipomersen이 ALT (liver alanine transaminase), AST (liver aspartate transaminase), 지방간증 (hepatosteatosis)을 증가시키는 것 같은 경향이 나타나 승인절차 도중 논란이 일었다. 결과적으로 mipomersen은 미국에서는, 특별한 제한 하에 심각한 가족성 고콜레스테롤혈증에 대한 치료제로 승인되었다. 유럽에서는, 장기간 사용에 대한 독성에 대한 우려로 EMEA 승인을 받지 못했다.

2세대 안티센스 치료제로써의 Mipomersen은 phosphorothioate와 2’-methoxyethyl 변형을 갖고 있다. Phosphorothioate 변형은 안티센스 계열에서 가장 널리 사용되는 화학적 변형으로, 인산기의 중합하지 않은 산소원자 하나가 황으로 대체된다. 이 작은 화학적 변화는 약리학적 특성에 큰 영향을 미친다. 분해효소에 대한 안정성이 증가되고, 높은 비율로 혈장단백질과 결합한다. 반대로 비특이적 단백질 친화도의 증가로 off-target effect가 나타날 수 있다. Off-target effect란 목표했던 유전자와 다른 표적에 영향을 미쳐 나타나는 부작용을 의미한다. Mipomersen을 포함하여 다른 안티센스 치료제에서도 이러한 Off-target effect는 실제로 상당한 부작용으로 나타남이 확인되었다. 특히 phosphorothioate는 주사부위, 간과 같이 약물의 농도가 높은 곳에서 독성을 유발한다. 안티센스 계열의 약물에서 논란이 되는 여러 문제들이 phosphorothioate 변형에서 유발되는 것으로 지금은 잘 알려져 있지만, 적절한 대체방법이 아직 없다. 뉴클레오티드의 리보오스(ribose)에 변형을 가하는 것(2’-methyl, methoxyethyl, other alkyl chain, locked nucleic acid (LNA))은 분해효소에 대한 안정성을 증가시키는데, 단백질 결합과 세포 내 흡수에 필요한 부분적인 phosphorothioate 변형과 함께 할 때에 효과적일 수 있다. 현재 임상평가 중인 차세대 안티센스 화합물은 비슷한 독성이 나타날 것으로 생각되지만, 높은 안정성 확보로 투여량이 감소하게 되어 독성이 낮게 나타날 것으로 예상된다.

스플라이싱 교정 올리고뉴클레오티드는 유전자 돌연변이 또는 잘못된 유전자 스플라이싱으로 인한 희귀질환에 고무적인 효과를 나타냈다. 희귀질환 Duchenne 근위축병(Duchenne muscular dystrophy)은 비기능성 dystrophin 단백질의 발현으로 유발된다. 유전자의 일부 결실로 인한 프레임시프트(frame-shift)가 나타나고 비기능성 단백질이 발현되는 것인데, 올리고뉴클레오티드로 스플라이싱되는 자리를 막아줌으로써 리딩프레임(reading frame)을 복원할 수 있다. 짧지만 기능성 단백질이 발현된다. 두 가지 올리코뉴클레오티드가 함께 개발되었는데, 한가지는 phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO)인 eteplirsen이다. 나머지 한가지 drisapersen은 임상 2상까지는 거의 부작용이 없는 결과를 보여줬으나, 임상 3상에서 임상적 이점이 크게 나타나지 않는 것으로 나타났다. 추가적인 시험이 진행 중이다.

현재까지 siRNA (short interfering RNA)는 아직 승인 받은 약물이 없다. RNA 간섭 현상이 1998년에 발견되었다는 사실을 고려하면 놀라운 것이 아니다. RNA 간섭의 작용기전을 밝히고, 서열의 디자인, 길이, 화학 변형 및 제제에 대한 연구에 10여년이 걸렸다. siRNA 약물에 대한 임상 평가는 최근 몇 년 사이 시작되었으며, 향후 수년 이내에 추가적인 몇 가지 유망한 약물들이 임상시험에 들어갈 것으로 예상된다.

2. siRNA 치료제 – 간에 존재하는 표적에 대한 효율적인 억제

초기 siRNA 치료제는 눈에 국소적으로 사용하는 데에 개발의 초점을 맞추었다. Bevasiranib은 Anti-VEGF siRNA로, 제형화되지 않은 상태로 임상 3상 시험까지 받았다. 하지만 임상반응이 낮게 나타나 임상시험은 곧 종료되었고, 더 신중한 전임상 단계의 필요성이 대두되었다. siRNA 치료제에서 해결되지 않은 주요 쟁점은, 물질의 안정성, 세포흡수, 엔도좀 탈출(endosome escape), 및 약동학적 특성과 관계된 것들이다. 변형되지 않은 siRNA는 원래 체내에 존재하지 않는 외인성 핵산으로써, 체액 내에 존재하는 효소들로 즉시 분해된다. 리보오스나 인산기의 다양한 화학적 변형을 통해서 체내 안정성을 증가시킬 수 있고, 핵산분해효소로부터도 보호될 수 있다.

다양한 변형으로 체내 안정성을 증가시킬 수 있지만, RNAi 복합체에 의해 조절되는 약동학적 효과를 손상시키지 않는 경우는 소수에 불과하다. 치료용 siRNA에 가장 유용한 변형은 제한된 수의 말단에 phosphorothioate를 도입하는 것과, siRNA 서열 전체에 분산하여 2’-O-methylation 또는 2’-F-nucleotide를 도입하는 것이다. 이러한 변형을 통한 구조적인 최적화는 siRNA의 체내 안정성을 증가시키고, 효소로부터 분해를 방지하므로 siRNA 자체가 약물로 사용될 수 있도록 돕는다. 신장을 통한 신속한 여과 및 배설은 피할 수 없는 과정이다. 안티센스 물질을 통한 많은 연구에서 phosphorothioate backbone 형태의 안티센스는 배설을 회피하고, 세포 흡수를 증가시킬 수 있음이 밝혀진 바 있다. 이와는 대조적으로 siRNA backbone의 너무 많은 변형은 RNAi 복합체를 통해 siRNA의 활성이 나타나는 것을 어렵게 만든다. 결과적으로, 화학적 변형을 통해 siRNA를 적절하게 안정화 시킬 수는 있지만, 리간드 접합 또는 약물전달을 위한 패키징방법 등의 추가적인 접근이 필요하다고 할 수 있다.

세포 흡수와 약동학적 특성의 개선을 위한 방법으로 다음 두 가지 방법이 각광받고 있다: 조직특이적인 흡수 및 축적을 증가시키기 위해 특정 수용체에 특이적인 리간드를 접합하는 방법과, 지질 입자 내에 패키징하는 방법이다(표 1). 지질 입자 내에 패키징하는 방법은, 수년에 걸친 지질 구조 및 조성에 대한 단계적인 발전을 통해 in vitroin vivo 효율이 향상되고 있다. 현재 가장 진보된 형태의 siRNA는 Alnylam 사의 patisiran (ALN-TTR02)이며, tranthyretin (ttr)유전자를 표적으로 하는 LNP 패키징된 siRNA이다. Patisirna는 transthyretin에 아밀로이드증(잘못 접힌 단백질에 의한 아밀로이드 침착물이 축적되는 희귀질환)을 치료하기 위해 만들어 졌다. 이 병은 돌연변이의 위치에 따라서 다발성 신경병증 또는 심근병증의 형태로 나타나고, 심근병증의 경우 심부전으로 이어진다. 임상 2상 시험에서 Patisiran은 정상 ttr 유전자와 돌연변이 ttr 유전자의 발현을 모두 효율적으로 감소시켜서 TTR 단백질의 생성을 감소시키는 것으로 나타났다. 단일 투여 후 수주 동안, 또는 다중 투여 후 6개월 동안 TTR 단백질의 발현이 80%까지 감소되었다. 운동 및 감각 신경 기능 및 심장 기능에 대한 임상효과를 평가하기 위한 임상 3상 시험이 2013년에 시작되었다.

표 1. 현재 임상시험이 진행중인 siRNA 치료제.
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- 각각의 전달 시스템, 화학적 변형, 투여경로를 열거하였다. 초기 개발단계(주로 변형되지 않은 siRNA의 국소적 투여)와 현재 진행중인 시도들(주로 간 관련질환에 대한 전신투여)을 모두 포함하였다.

같은 회사에서 TTR-아밀로이드증에 의한 심근병증을 치료하기 위해 피하투여가 가증한 an-ti-TTR-siRNA를 개발 중에 있다. 리간드로 N-acetylgalactosamine (GalNAc)가 siRNA의 센스가닥(sense strand)에 접합되어 있고, asialoglycoprotein 수용체를 통한 수용체 매개 엔도사이토시스가 가능하다. 사람에서 임상 1상 시험에서 10mg/kg siRNA 접합체를 투여하였을 때, 용량의존적 방식으로 TTR 단백질이 최대 94%까지 감소하였다. 3가 GalNAc의 접합(즉 하나의 siRNA 분자에 3개의 탄수화물 분자가 결합)으로 수용체에 대한 높은 친화성이 나타나고, Kd값이 감소되며, 2가 접합체에 비해 마우스 간세포에 대한 세포흡수가 약 10배 증진되었다. 생체 내 분포의 경우 투여된 양의 50% 이상이 간에 분포하는 것으로 나타났다. 생체접합체를 사용하여 siRNA를 목표세포에 전달하고 흡수시키고자 할 때는, 세포 외 조직 및 혈액 순환 중 대사 안정성을 증진시켜야 한다. 따라서, siRNA의 화학적 변형은 LNP-매개 약물전달 방법보다 더 중요하다. 말단 phosphothioate 결합과 함께, 여러 핵산 변형(2’-OMe, 2’-F, 2’-deoxy)을 잘 조합함으로써 siRNA의 반감기를 증가시키고, 마우스에서 표적유전자의 발현저해 효율을 증가시킬 수 있었다. 세포 내 안정성이 높아짐에 따라 더 효율적인 RNA 간섭이 일어났기 때문으로 보인다. Alnylam 사는 GalNAc 접합체를 이용한 여러 가지 siRNA 제제를 개발하였다. 혈우병과 희귀 출혈질환에 대한 ALN-AT3, B형 간염 바이러스에 대한 ALN-HBV, 고콜레스테롤혈증에 대한 ALN-PCSsc 등이 있다.

Arrowhead Research Corporation 사에서는 탄수화물 GalNAc를 anti-HBV siRNA의 간세포로의 표적화와 세포흡수를 위해서 활용한다. GalNAc를 siRNA에 공유결합 시키는 대신, amellitin-유사 중합체로 이뤄진 캐리어 분자에 결합시킨다. 캐리어는 엔도솜 내의 산성 환경에서 분해된다. 이른바 다이나믹 다중접합체(dynamic polyconjugate, DPC)는 추가적인 PEG-마스킹 리간드(PEG-masking ligand)를 사용한다. PEG-마스킹 리간드는 마찬가지로 산성 pH에서 절단 되는데, 양성자 스폰지효과(proton sponge effect)를 통해서 siRNA의 엔도좀 탈출을 증가시킨다(즉 수소이온의 엔도좀 내 유입과, 뒤 따른 물의 유입을 촉진하여 엔도좀이 팽창하여 파괴됨). 처음에 제시된 다중접합체는 불안정한 이황화공유결합을 통한 siRNA와 중합체의 결합에 의존적이었지만, 최근에는 단순히 siRNA와 캐리어를 함께 사용하는 것으로 진화하였다. 전하가 없는 캐리어와 siRNA는 상호작용이 약하기 때문에, 중합체가 siRNA의 흡수에 영향을 미치는지, 또는 단순히 엔도좀 탈출을 증가시키는 보조제로써 기능을 하는지는 명확하지 않다. 형질전환 마우스 모델에서 혈청 내 바이러스 마커가 1% 미만으로 효과적으로 감소되었다. 사람의 경우 최근 임상 2상 시험이 시작되었다. 2mg/kg 용량의 siRNA 투여 후 바이러스 마커가 약 50%까지 감소되었음이 보고되었고, 고용량에서의 결과는 아직 보고되지 않았다.

최근 microRNA (miRNA)에 지식이 넓어지면서, 치료제로 응용하기 위한 miRNA 유사 올리고뉴클레오티드의 개발이 활발히 진행되고 있다. Phosphorothioate/LNA-변형 단일가닥 올리고뉴클레오티드 miravisen은 HCV 바이러스 복제에 필수적인 miR-122와 HCV RNA의 상호작용을 차단한다. Pre- 및 Pri-miR-122 전구체와의 결합을 통해서 정상적인 miRNA 가공과정을 저해하는 것 또한 약효에 기여하는 것으로 보인다. Miravisen은 현재 HCV 바이러스 감염에 대해 임상 2상 시험이 진행 중이다.

많은 siRNA, miRNA, 안티센스 기반 치료제들이 간 조직에서의 표적 억제효과를 나타냈다. 조직 특이적인 세포흡수와 축적에 있어서 가장 성공적인 방법은 수동적(지질 입자) 또는 능동적(asialoglycoprotein 수용체 리간드)으로 간세포를 목표로 하는 것이었다. 지질 입자는 주로 그 크기 때문에 간으로 직접 유입되며, GalNAc 접합체는 주로 간세포에 발현되는 수용체를 표적으로 한다. 이들 약물들은 siRNA 기술의 효능을 증명하고, 요구되는 투여량, 표적 유전자의 검증, 해당 임상효과에 등에 대한 정보를 수집하는 도구가 될 것이다. 또한 포괄적인 약물 안전성 평가는 모든 종류의 siRNA 치료법에 영향을 미칠 것이다. 치료에 더욱 적극적으로 활용하기 위해서는 간 이외의 조직 및 종양으로 전달을 확장할 수 있는 방법의 개발이 필수적이다.

siRNA 올리고뉴클레오티드의 적용 대상은 모든 유전자 전사체로 확장될 수 있다. 대부분의 전통적인 소분자 약물은 단백질의 특정 결합자리를 표적으로 한다. 때문에 약물이 적용 가능한 표적이 제한된다. 소분자 약물의 질병 관련 표적은 약 1000개 정도로 추정되며, 그 중 30% 미만이 현재 치료를 위한 표적으로 이용되고 있다. 치료용 항체가 등장하면서 세포 밖 표적들까지 약물 표적이 확장되었다. siRNA는 유전자의 번역과정을 방해하기 때문에, 모든 유전자 산물이 약물 표적이 될 수 있다. 일반적으로 소분자 약물보다 개발과 생산 비용이 많이 들고, 약동학적 특성들과 관련하여 해결해야 할 점들이 있지만, 소분자 약물로는 해결할 수 없었던 표적까지 작용할 수 있다는 것이 가치가 크다고 할 수 있다. 하지만, siRNA는 현재 유전자 번역을 억제하는 방향으로만 작용한다. 따라서, 표적 유전자의 과발현과 관련되고, 다른 치료법이 없는 질병을 목표로 약물개발을 진행하는 것이 바람직하다.

분자수준에서의 특이성에도 불구하고, 올리고뉴클레오티드 치료제는 부작용이 선험적으로 배제된다는 의미에서 마술총알(magic-bullet)은 결코 아니다. 서열특이적 또는 서열비특이적 off-target 효과들은 잘 연구되어 있다. 서열특이적인 off-target 효과는 의도한 표적 유전자 외의 유전자와 결합함으로써 나타나는데, 올리고뉴클레오티드 서열을 세심하게 디자인함으로써 막을 수 있다. 서열비특이적 off-target 효과는 단백질과의 결합, 특히 Toll-like 수용체(Toll-like receptor)와 같은 면역활성 수용체와의 결합 등에 의해 유도된다. 부작용은 질환과 관계없는 기관이나 조직에서 표적유전자를 너무 강하게 침묵시킴으로써 나타날 수도 있다. 예를 들면, 암세포를 표적으로 공격할 때, 종양에서의 특정 유전자가 과발현되는 것을 표적으로 침묵시키는데, 정상세포에서 기본적으로 발현되는 표적 유전자도 억제될 수 있음을 고려해야 한다. 결과적으로, 다른 치료제들과 마찬가지로 siRNA의 표적지향적인 전달은 효능과 낮은 부작용을 위해서 siRNA의 서열 특이성 못지않게 중요하다고 할 수 있다. 물론 siRNA의 표적지향적인 전달특성은 다른 약물들의 전달특성과 많은 측면을 공유하지만, 올리고뉴클레오티드 전달에 특이적인 측면들도 있다. 다중음이온성 중합체인 핵산은 효율적으로 패키징되고 분해로부터 보호될 필요가 있다. 성공적인 세포흡수 이후에는 세포질로 잘 방출되어야 한다. 대부분의 저분자 화합물 약물들의 경우 세포질로의 수송이 약효에 결정적이지 않은 것과 대조적이다.

2.1 생체 장벽 및 생체 내 분포(Barriers and biodistribution)

siRNA 치료제가 그 작용 장소인 세포질에 다다르기 위해서는 많은 생체 장벽들을 극복해야 한다. 전신투여(정맥투여 등) 후 siRNA 치료제는 혈액순환을 거쳐 각 장기에 분포하게 되어 신장으로의 배설을 피하게 된다. 각 장기에 도달한 siRNA 화합물은 혈관내피세포 장벽을 뚫고 간질로 이동해야 한다. 간질을 이동한 siRNA는 표적세포에 결합하고 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 흡수된다. 흡수된 siRNA 화합물은 엔도좀을 뚫고 나와야 RNAi 복합체와 만날 수 있다. 이러한 모든 과정은 여러 가지 투여방법에 따라 큰 영향을 받고, 적절한 해결책이 필요하다.

정맥주사 외에도 피하주사, 피내주사, 폐 또는 코 점막을 이용한 투여방법은 혈류를 통하게 된다. 하지만 이러한 방법들은 추가적으로 극복해야 할 장벽을 수반하므로 현재의 임상적인 시도들은 피하주사 또는 정맥 내 주사(완전한 흡수가 예상되는)에 집중되어 있다. 우선 피하주사 또는 정맥 내 주사를 통한 효율적인 전달 시스템이 개발되어야 하며, 그 후에 다양한 다른 경로로 확장 적용될 수 있을 것이다.

피부는 넓은 범위에 쉽게 접근할 수 있다는 점에서 매력적인 투여 경로이다. 피부 장벽은 투과성이 없는 각질세포층과, 연속적인 각질층으로 이뤄져 있다. 크기가 큰 친수성 물질을 피부장벽을 뚫고 투여하기 위한 가장 확실한 방법은 미세바늘을 사용한 물리적 방법이다. 치료용 siRNA는 스테인리스 바늘에 코팅하거나 미세바늘장치를 통해 주입할 수 있다. 표피에서의 흡수 및 유전자 침묵효과는 잘 나타났으나, 진피 모세혈관층으로의 흡수는 거의 나타나지 않았다. 피부질환 부위에 바늘을 사용하는 것은 통증을 수반하므로 임상적 사용에 한계가 있었다.

이와 유사하게 siRNA를 폐에 적용하는 방법 또한 국부적인 영향만을 나타낸다. 전임상단계에서 성공적이었던 많은 siRNA들이 실제 임상에서 적용될 수는 없었다. 비강 및 기관 내 흡입을 통한 전달 방법으로, 지질(중성 및 양이온성), 고분자(polyethyleneimine (PEI), poly (lac-tic-co-glycolic acid) (PLGA) 등), 무기물질 캐리어(탄산칼슘, 다공성 실리카 입자) 등이 시도되었다.

혈액 등의 체액 내의 핵산분자는 말단 뉴클레오티드의 인산결합을 절단하는 exonuclease에 의해서 빠르게 분해된다. 핵산을 내부 인산결합부터 절단하는 endonuclease에 의한 분해는 적다. 따라서, 외인성 올리고뉴클레오티드는 말단부위에서부터 단계적으로 분해되어 짧아진 형태의 올리고뉴클레오티드를 형성하게 된다. 본래의 올리고뉴클레오티드와 짧아진 올리고뉴클레오티드 모두 신장 여과를 통해 제거된다. 거대분자의 여과 한계는 약 2~4nm로, 20~40kDa 정도의 핵산에 해단된다. PEG(polyethylene glycol)와 같은 리간드를 부착하거나, 혈장단백질과 결합함으로써 입자의 크기를 크게 만듦으로써 siRNA의 신장 여과를 막을 수 있다.

한편, 크기가 큰 입자는 세망내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의해서 차단된다. 일반적으로 200nm가 넘는 입자는 간과 비장에서 주로 발견되는 대식세포에 의해 빠르게 제거된다. 그러나 PEG와 같은 양친매성 물질을 달아줌으로써 RES를 회피할 수 있다.

혈관내피세포는 기관으로의 약물분포를 결정한다. 거대분자와 나노입자는 주로 대류(convection)에 의해 혈관 밖으로 유출되며, 모세혈관을 통과하는 유량이 증가할수록 증가된다. 혈관내피세포 장벽을 가로지르는 정도는 모세혈관의 구멍 크기에 좌우되며, 이는 사용할 수 있는 입자크기의 상한선으로 작용한다. 기관이나 조직에 따라서 혈관내피세포 사이의 접합은 매우 치밀하기도 하고(혈액뇌장벽), 헐겁기도 하다(소화기관의 점막). 간의 경우, 다른 림프조직과 조혈기관과 마찬가지로, 불연속적인 굴모세혈관(sinusoidal capillary)으로 이루어져 있다. 이들은 연속모세혈관(continuous capillary)이나 유창모세혈관(fenestrated capillary)과 달리 구멍을 덮고 있는 막이 없기 때문에, 매우 우수한 투과성을 보이며 거대분자의 교환이 가능하다. 언급한 것처럼 siRNA 전달 시스템의 경우 간으로 잘 전달된다는 특성이 있다. 이것은 지질기반의 입자, 양이온성 또는 중성 나노입자, 지질친화성 리간드 접합체와 관련이 있다. 간 혈관계의 불연속성(나노입자, 단백질에 결합한 올리고뉴클레오티드) 또는 간에서의 지방대사(리포좀, 지질 또는 콜레스테롤 접합체 사용) 때문에 간으로의 축적이 나타난다. 서로 다른 종류의 간세포를 구별할 수 있는 특정 수용체를 표적으로 하는 리간드를 사용함으로써, Kupffer 세포(간에 상주하는 대식세포) 내에만 축적되는 것을 방지할 수 있다. 3가 GalNAc 접합체는 간세포로의 흡수를 증가시키고, 결과적으로 간세포 내에서의 유전자 침묵을 일으킨다. Asialoglycoprotein 수용체는 효율적인 엔도사이토시스를 일으킨다.

몇몇 질병은 조직에서의 모세혈관 투과성을 변화시키기도 하는데, 특히 종양의 경우, 모세혈관의 구멍을 증가시켜 큰 분자와 입자가 통과할 수 있다. 이런 기이한 특징은 EPR 효과(enhanced permeability and retention effect)라고 알려져 있다. EPR효과는 종양에 대한 나노입자의 수동적인 타겟팅에 매력적인 방법이다. 실제로 EPR 효과는 마우스 모델에서 종양세포에 나노입자가 축적되는 것을 설명하기 위해 적용되어왔다. 한편, 수동적인 타겟팅은 종양에서 최대 20%의 축적을 보이며, 혈관 누출 정도는 종양의 유형 등에 따라 다르게 나타난다. 혈관근처의 종양 성장, 종양 내 압력, 및 신생혈관형성 속도는 모두 EPR 효과의 불균등함에 기여하는데, 이들은 종양 모델마다, 개개인의 환자마다, 또는 하나의 종양 내에서도 다르게 나타난다. 동물에 이식한 종양 모델은 사람에서보다 훨씬 빠른 성장을 나타내기 때문에, 혈관의 구멍은 일반적인 전임상시험 모델보다 더 크고, 때문에 EPR 효과가 과장되어 해석되는 경우가 많다. 실제 치료환경에서 나노입자 종양세포 타겟팅에 대한 명확학 임상적 증거는 아직 밝혀지지 않았다.

혈액뇌장벽(Blood-brain barrier, BBB)은 혈관내피세포 사이의 매우 치밀한 접합에서 기인하며, 뇌 조직으로의 자유로운 물질 확산을 방지한다. 치료목적으로는 지질 친화성이 높은 400Da 이하의 분자량 갖는 물질 또는 능동적 수송 시스템이 존재하는 물질만이 뇌에 접근할 수 있다. 생체거대분자 및 나노입자 전달 시스템은 혈액뇌장벽을 통과할 수 없어 치료에 적용하기 어려웠다. 핵산분자를 수송할 수 있는 특정 능동수송 시스템이 없으므로, BBB 트랜스사이토시스를 활용한 전략의 개발이 필요하다. BBB 특이적인 세포 외 마커들이 존재하며, 다른 조직의 혈관내피세포에서도 특이적인 수용체가 발견되기도 한다.

간에만 축적되는 것을 피하고, 다른 기관에서 siRNA를 통한 표적 유전자 침묵을 달성하기 위해서는 수용체 특이적인 리간드의 사용이 필수적으로 보인다.

2.2 세포 내 흡수 및 세포 내 움직임(Cellular uptake and intracellular trafficking)

혈관내피세포를 뚫고 나와 간질을 지나면, 세포막이 기다리고 있다. 어쩌면 가장 어려운 장벽일지도 모르는 세포막을 통과하는 것에 대한 많은 연구가 이뤄졌다. siRNA 자체이건 접합체가 결합된 형태이건 siRNA의 주된 흡수 방법은 엔도사이토시스로 생각된다. 엔도사이토시스가 일어나는 경로는 여러 가지가 있다: clathrin-매개 경로, caveola 의존적인 흡수, clathrin이나 caveola와 관계없는 경로, 피노사이토시스(pinocytosis, 음세포작용). 대식세포, 과립구, Kupffer 세포 등에서는 포식작용이 일어난다. 이들 각 기전들 사이에는 중요한 차이들이 존재하기는 하지만, siRNA 치료제 흡수의 최후는 엔도좀 소포를 이루는 것이다.

siRNA이 기능적으로 활성을 나타내기 위해서는 엔도사이토시스 과정보다 엔도좀을 탈출하는 것이 더 중요하다. 일반적으로 소수의 siRNA 분자만이 엔도좀에서 세포질 내로 옮겨지고, 나머지는 라이소좀(lysosome)과의 융합으로 분해된다. 엔도좀의 세포 내 움직임에 대해서는 완전하지는 않지만 어느 정도 연구가 되어있다. 엔도좀 시스템은 대부분이 세포막으로 다시 회수되는 점이 특징이다. 초기 엔도좀 속의 화합물은 특별한 경로를 통해서 세포 내로 흡수된다. 초기 엔도좀은 세포막으로 다시 회수하거나, 엔도좀을 성숙시켜 후기 엔도좀이 되거나, 라이소좀과 융합하거나, 목표구획으로 엔도좀을 전달시키는 등 엔도좀에 결합된 세포질 내 단백질에 의해 운명이 결정될 수 있다. Rab family, 특히 Rab5는 이 과정의 중요한 조절인자 중 하나이다. 모터 단백질은 actin이나 tubulin 미세소관을 통한 세포 내 표적 소기관으로의 이동을 담당한다. 엔도좀의 세포 내 움직임에 대한 많은 연구에도 불구하고, 엔도좀으로부터 화합물을 탈출시키기 위한 합리적인 수단이 부족하다. 리포좀, 고분자, 수용체 특이적인 리간드를 통해 흡수된 siRNA가 실제로 세포질 내에 도달하는 양이 어느 정도인지 명확하지 않다. 물리적인 기전을 통해 엔도좀 탈출을 증가시키려는 시도는 있었다. 이른바 양성자 스폰지 효과(proton sponge effect)는 염기성 거대분자(펩타이드, 고분자 등)의 산성화를 통해 라이소좀 내에 수소이온이 유입되는 것을 말한다. 양성자의 유입으로 물의 유입과 그에 따른 소포의 팽창이 일어나고 결국 터져서 세포질 내로 화합물이 방출될 수 있다. siRNA의 세포질 내 전달을 증가시키기 위한 다른 전략으로 라이소좀과 엔도좀의 막융합을 이용하는 방법이 있다(산성 pH에서 단백질들의 구조가 변하고 서로 융합하여 투과성이 증가한다). 하지만 이러한 방법은 실제 치료적 조건에서 siRNA 효과의 증가를 나타내지 않았고, 안전 조건도 만족시켜야 한다. 엔도좀의 세포 내 움직임에 대한 지속적인 연구는 올리고뉴클레오티드의 엔도좀 탈출을 개선하는데 도움이 될 것이다.

성공적인 siRNA의 세포 내 전달을 위해서 입자크기, 전하, 안정성, 표면의 접합체, 수용체 특이 리간드의 존재 등 다양한 변수가 있음을 알 수 있었다.

2.3 BBB 트랜스사이토시스(BBB transcytosis)를 위한 표적 및 리간드

종양, 뇌, 혈관내피와 관련된 질환에 대한 siRNA 치료제 전달은 아직 개발이 필요하다. 선택적인 약물전달을 위해서는 장기, 조직, 종양에서만 특이적으로 발현되거나 특별히 많이 발현되는 표면 수용체가 필요하다. 혈관내피 조직간의 유사성과, 종양에서의 발현 패턴의 다양성 등 때문에 이런 수용체를 찾는 것은 쉬운 일이 아니다(표 2).

표 2. 뇌, 백혈구 및 종양조직에 대한 표적화된 siRNA 전달 시스템.
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- 수용체 특이적 리간드, 각각의 표적, siRNA 제형(나노입자 또는 생체접합체)을 함께 짝지었다.

BBB를 통과하는 siRNA 전달을 위해서는 트랜스사이토시스를 유발하는 transferrin 수용체가 가장 빈번한 표적이 된다. 인슐린 수용체와 LDL 수용체 또한 BBB에 대한 siRNA 전달에 사용된다. Transferrin 수용체를 표적으로 한 전달방법은 약물의 성공적인 뇌 내 흡수를 보여줬다. 하지만 뇌의 미세혈관 뇌에서 포획되는 케이스도 보고되었다. 최근에는 transferrin 수용체와 리간드의 친화도가 결정적으로 중요함이 보고되었다. 친화성이 높은 리간드는 낮은 리간드에 비해 적은 뇌 축적을 나타냈다. In vivo 이미징을 통해서 친화성이 높은 리간드는 세포 내에서 라이소좀으로 운반되고 분해됨이 밝혀졌다. 때문에 transferrin 수용체 자체도 감소하게 되고, 2차적인 약물의 효과도 감소시킨다.

많은 핵산 전달 시스템에서 뇌 내 축적이 크게 증가하였다. 혈액뇌장벽을 표적하기 위해서 다양한 리간드들(holo-transferrin, transferrin 항체, 변형된 디프테리아 독소, angiopep-2, apoE유사 펩타이드)이 리포좀에 접목되었다. Transferrin 항체를 접목한 리포좀만이 마우스 in vivo 모델에서 뇌 축적을 크게 증가시켰으나, 뇌로 흡수되는 양은 투여량 대비 0.1% 미만이다. 투여된 양의 대부분은 간으로 분포한다. 유전자 전달을 위해서 리포좀은 transferrin 수용체와 인슐린 수용체에 대한 단클론항체 및 PEG 사슬로 수식된 리포좀이 여러 연구에서 사용되었다. 이종이식 신경교종(glioma) 마우스 모델에서 랫(rat) transferrin 수용체 항체와 사람 인슐린 수용체 항체를 도입한 리포좀을 이용했을 때, RNA 간섭을 위한 플라스미드가 종양으로 활발히 운반되었다. 목표했던 EGF 수용체 유전자의 효율적인 침묵이 나타났고 생존기간도 증가되었다. 이러한 접근 방법이 더 많은 축적을 필요로 하는 올리고뉴클레오티드 전달에도 성공할지는 확실하지 않다.

최근에는 siRNA의 축합과 선택적인 뇌 흡수를 위해서 myristoylated transportan과 transferrin 표적 서열이 융합된 펩타이드가 사용되기도 하였다.

BBB를 통과하는 siRNA 전달을 위해 광견병바이러스의 당단백질(rabies virus glycoprotein, RVG) 또한 사용되고 있다. 29개 아미노산의 펩타이드는 광견병바이러스가 숙주세포에 부착, 흡수될 때 필요한 성분이다. RVG와 상호작용하는 수용체와 정확한 전달 기전은 아직 연구되지 않았다. Nicotinic acetyl choline 수용체, 신경세포 접착분자(neuronal cell adhesion molecule, NCAM), 신경 성장인자 수용체(p75NTR) 등이 가능성이 있어 보인다. 이들은 광견병바이러스의 흡수와 감염에 홀로 필수적이지는 않지만, 각각의 돌연변이에서는 바이러스 감염에 대한 감수성을 나타냈다. 연구결과들은 하나 이상의 수용체가 RVG의 흡수에 관여하고 있음을 나타낸다. 밝혀진 수용체는 뉴런세포에 존재하지만 BBB 혈관내피세포에는 존재하지 않기 때문에, RVG 매게 방법이 어떻게 뇌로 운반을 일으켰는지는 명확하지 않다. 광견병 바이러스는 역행성 축삭 수송에 의해 이동됨을 고려할 때, 말초신경세포에 흡수되어 BBB를 넘어서 이동되는 것인지도 모른다.

RVG의 중추신경계 지향적인 특성을 효과적으로 이용하기 위해, Arg 9개와 융합하여 핵산화합물 복합체를 형성하도록 하였다. 이 시스템은 신경세포 특이적이었으며, siRNA 화합물을 뇌에 성공적으로 전달하고 유전자 침묵을 일으켰다. PEI, 리포좀 및 polyamidoamine (PAMAM) 덴드리머를 이용한 비슷한 시스템도 개발됐다. 높은 전하를 띠는 구형 PAMAM 덴드리머에 RVG가 접합되었을 때, 뇌 축적이 크게 증가하였다. 꼬리정맥을 통한 투여 후, RVG가 접합된 리포좀은 높은 뇌 축적을 나타냈지만, 리간드가 접합되지 않은 리포좀은 BBB를 통과하지 못했다. 이황화결합을 통해 RVG를 부착한 PEI 캐리어를 이용했을 때는, in vitro에서 Neuro2a 세포 흡수가 증가되었고, in vivo에서도 뇌 축적이 크게 증가하였다. 큰 크기 때문인지, 간에서의 대식작용을 통한 흡수도 유의미하게 나타났다. 뉴런세포에서의 흡수는 bungarotoxin (nicotinin acetylcholine 수용체에 결합함)에 의해 경쟁적으로 억제됨을 보였다. 흡수는 GABA에 의해서도 억제되었는데, GABAB 수용체가 관여하고 있을 수도 있음을 시사한다.

RVG 펩타이드는 엑소좀(exosome)을 이용한 시스템에도 활용되었다. 엑소좀은 생체 내에서 만들어 지는 소포체의 한 종류로 세포간 small RNA의 수평이동에 관여한다. 세포 내부에서 엔도좀과 비슷하게 형성되어 세포 외부로 엑소좀으로 배출될 수 있다. 다른 소포들과는 다르게 엑소좀은 그 직경이 100nm정도로 작다. RVG 펩타이드를 엑소좀 시스템에 도입하여 정맥투여 하였을 때, 마우스 뇌에서의 siRNA-매개 GAPDH, BACE1 유전자 침묵을 일으킬 수 있었다. 종합적인 생체분포데이터는 없지만, 엑소좀 시스템은 간 축적률도 낮은 것으로 보인다. 앞서 언급한 엑소좀-RVG 시스템에서 간에서는 GAPDH의 발현저해가 나타나지 않았다. 입자의 크기가 작은 특성 때문에 실제로 간에 축적되지 않는 것인지, 또는 단지 siRNA가 간에서 잘 방출되지 않은 것인지는 확실하지 않다. 비강 내 투여를 사용한 다른 연구에서는, 엑소좀(30-100nm)와 마이크로입자(0.5-1um) 모두 간 축적은 나타나지 않았다. 마이크로입자는 폐에 침착되었고 혈류까지 도달하지 못했다. EGFR-엑소좀을 꼬리정맥을 통해 투여하였을 경우는 상당한 간 축적을 나타냈다.

2.4 백혈구와 혈관내피세포에 대한 표적 및 리간드

Integrin은 세포접착분자(cell adhesion molecule)에서 가장 큰 계열로, α와 β 소단위체로 이뤄진 이종이량체(heterodimer)단백질이며, 다양한 생리학적 상황에서 세포-기질, 세포-세포간 상호작용을 중재하는 역할을 한다. 이들은 세포표면에 광범위하게 분포하고 있고, 효과적인 세포내함입(internalization)을 일으키므로 수용체 매개 약물전달의 타겟으로 관심이 높다. 24개의 integrin 계열 중, β2, β7 integrin은 백혈구에서만 발현된다. 포유동물의 α8 integrin은 혈관과, 내장평활근, 신장 사구체 및 폐포에서 특이적으로 높게 발현된다. 랫 폐에서 anti-α8 integrin 항체로 면역염색되는 세포는 폐포 간질에 있는 근섬유모세포(myofibroblast)이다. 폐포 근섬유모세포는 폐포표피와 기저막에 인접하여 모세혈관을 따라 존재한다. 또 다른 integrin 단백질들이 종양혈관계 등에서 발견되기도 한다.

조직에 분포하는 integrin을 살펴보면 integrin의 기능을 추측할 수 있다. 다양한 세포유형에서 광범위하게 발현되는 integrin도 있지만(α2β1, α3β1 등), 제한된 분포를 갖는 integrin도 있다. αIIb 소단위체는 오직 혈소판에서만 발현되며 혈소판 응집의 매개체가 되는 것으로 여겨진다. 종양 혈관내피세포에서는 αVβ3 소단위체의 발현이 증가되어있고, β2과 β7 소단위체는 거의 백혈구에서만 발견된다. 대부분의 integrin의 발현은 발생학적으로 조절된다. 예를 들어 α4β1 integrin은 배아 발달시기 동안 광범위하게 분포하지만, 성인의 경우 백혈구와 내피세포에서 발견된다.

백혈구를 표적으로 하기 위해서 integrin 항체에 기반한 전달 시스템이 개발되었다. LFA-1 integrin(백혈구 특이적인 β2 소단위체를 가짐) 항체를 protamine에 융합하여 siRNA 복합체를 형성하였다. 이 시스템은 LFA-1 수용체를 발현하는 외인성 K562 세포에 특이적으로 siRNA 복합체를 전달하는데 성공하였다. 비슷한 방법으로 β7 integrin 소단위체에 대한 항체를 hyaluronan을 통해 리포좀 표면에 도입하여 백혈구 특이적인 유전자 침묵을 일으켰다. 표지된 지질입자를 사용하여 생체 내 분포를 조사했는데, 염증이 있는 장에서 3.5배정도 분포가 증가하였다. 입자크기가 크므로 간과 비장에서의 현저한 축적도 역시 나타났다.

종양 내피세포에서 증가된 αVβ3 integrin의 발현을 이용하여, cyclic RGD를 도입한 양이온성 지질을 이용한 siRNA 전달이 가능하였다. In vitro에서 αVβ3 integrin은 성공적인 흡수 및 유전자 침묵에 필수적이었고, 실제 In vivo에서 종양내피세포 특이적인 유전자 침묵을 일으킬 수 있었다. 펩타이드 리간드의 변형에 따라 생체 내 분포 패턴이 달랐고, 간에 축적되는 양이 감소하는 만큼 비장이나 폐, 신장에서의 축적이 증가되었다. 하지만 투여량의 50% 이상이 여전히 간에 남아있었다. PAMAM 덴드리머에 RGD 펩타이드가 도입되기도 하였는데, 세포막과의 전하를 통한 결합능력이 강한 덴드리머의 본질적인 성질 때문에, 리간드로 인한 추가적인 세포 흡수의 증가는 나타나지 않았다. 그러나 종양에 대한 더 깊은 침투능력을 나타냈는데, αVβ3과 RGD 펩타이드의 결합으로 세포외 기질과의 상호작용이 저해되었기 때문으로 생각된다.

αVβ3 integrin을 발현하는 세포를 표적으로 하기 위해 siRNA에 Cyclic RGD 펩타이드가 결합되었다. RGD의 이온가수(valency)가 증가함에 따라 세포흡수는 증가되었지만, 기능적인 효과와의 상관관계는 명확하지 않다. 3가 또는 4가 접합체만이 표적세포의 luciferase 리포터 활성을 감소시켰으며, 세포흡수가 증가되는 것과 달리 50nM siRNA 농도에서 유전자 침묵효과는 포화되었다.

2.5 종양에 대한 표적 및 리간드

종양에서 과발현되는 표면 수용체는 올리고뉴클레오티드 치료제를 종양에 도입하기 위한 표적이 된다. 이상적인 표적 수용체는 정상적인 세포에서는 거의 발현이 안되고 악성세포에서만 강하게 발현되어야 한다. 또한 수용체에 대한 접근이 용이해야 하고, 종양 내에 골고루 분포되어 있어야 하며, 리간드가 결합했을 때 신속하게 세포 내 함입이 이루어져야 한다. 이러한 조건을 만족하는 수용체는 매우 적으며, 종양세포들 자체의 불균등함과 빠른 내성 획득 때문에 더욱 복잡해진다. 자주 사용되는 수용체는 Her2, 표피성장인자 수용체 EGFR, 상피세포부착분자 EpCAM 등이 있다.

엽산(folate) 수용체 또한 암세포에서 종종 발현된다. siRNA의 전달을 위해 엽산 수용체를 표적으로 한 몇 가지 보고들이 있다. Dextran과 LPEI로 구성된 나노입자 시스템을 사용하여 엽산 수용체를 표적으로 siRNA를 전달한 보고가 있었다. siRNA와 엽산 모두 PEI와 응축되기 전에 dex-tran에 공유결합으로 연결된다. In vivo에서 이 시스템은 이종이식(xenograft) 모델에서 성공적으로 GFP 발현 레벨을 감소시켰고, 종양 축적이 증가된 생체 내 분포를 나타냈다. 증가된 종양에서의 축적은 비장에서 축적되는 양이 감소하는 것과 관련이 있다. 엽산 수용체에 대해 PEI 기반의 유사한 시스템들이 in vitro, in vivo에서 평가되고 있다.

Hyaluronic acid는 glycosaminoglycan으로 상피와 신경조직 등을 포함한 다양한 조직에 널리 분포한다. 원형질막에서 생성되며 세포외기질의 주요성분을 이루고, 세포 이동, 증식, 종양성장 등에 기여한다. 이 거대 분자는 CD44의 리간드로 작용하는데, CD44는 종양에서 과발현된다. Hyaluronic acid와 양이온성 고분자 캐리어를 접합하여 종양특이적으로 siRNA를 전달하는데 사용한 보고가 있었다. 이종이식 마우스 모델에서 siRNA를 종양세포에 효율적으로 전달하였으며, 형광 리포터 유전자에 대한 침묵을 유도하였다.

Her2를 매개한 방법으로는 B형 간염 바이러스의 L 단백질(바이러스 표면 항원 단백질 HBsAg), 지질이중층, Her2 항체를 이용한 방법이 최근에 보고 되었다. In vitro에서 Her2 양성 세포에 대한 선택성과 유전자 침묵을 나타냈으며, in vivo 데이터는 아직 보고되지 않았다. 시그마 수용체의 리간드인 Anisamide가 이용되기도 하였다. 지질/protamine siRNA 나노입자의 표면에 도입된 amisamide는 세포 내 흡수를 돕는다. 이종이식 마우스 모델에서, amisamide 리간드는 추가적인 종양 축적의 증가를 나타내지는 않았다. 흥미롭게도 이 입자는 간보다 종양에서 더 높은 축적을 나타냈다. 입자크기로 인해 간에서의 유출이 방지됐을 수도 있고, 특정 이종이식 모델에서만 나타나는 현상일수도 있다. 비록, 종양으로의 전달을 증가시키지는 못했지만, anisamide를 사용한 전달 시스템은 성공적인 유전자 침묵을 일으켰다.

3가 anisamide 리간드를 스플라이싱 교정 올리고뉴클레오티드에 적용한 연구에서, 사람의 전립선암에 대한 세포 내 흡수가 증가되었고, 배양세포에서 유전자 침묵 효율 또한 4배가량 증가되었다. 신경세포와 면역세포에 높게 발현되는 cannabinoid 수용체는 anandamide 리간드를 인식한다. 이를 이용한 siRNA 접합체는 고용량이 필요하기는 했지만, 배양세포에 성공적으로 흡수되었고, 목표유전자의 침묵효과를 나타냈다.

펩타이드들도 올리고뉴클레오티드에 쉽게 부착될 수 있다. G단백질 연결 수용체(G protein coupled receptor, GPCR) BB2는 많은 악성종양세포에서 발현된다. BB2 수용체에 선택적인 히스티딘이 풍부한 펩타이드를 올리고뉴클레오티드에 결합하여, 사람 전립선암 세포에서 성공적인 스플라이싱 교정을 유도하였다. 하지만 약리학적 효과는 크지 않아서, 실제 치료에 적용할 수 있을지는 미지수이다.

Protamine과 같은 염기성 펩타이드와 융합한 항체를 이용한 전략도 있다. 양이온성 펩타이드에 Fab 단편을 융합시킴으로써 전하를 통한 siRNA와의 복합체 형성을 가능하게 한다. 항원 의존적인 조직 특이적 유전자 침묵 효과가 in vivo에서 확인되었다. 이종이식 마우스 모델에서 HIV 바이러스의 gp160 표면단백질에 대한 Fab 단편 융합을 사용하여, siRNA의 선택적인 전달과 효과를 나타낸 결과가 있었다. 유사하게, integrin에 대한 단일가닥 항체 단편을 이용한 경우나, 조류 인플루엔자 바이러스의 hemagluttinin 항원에 대한 항체 단편을 이용할 경우가 있었다. 융합 단백질은 단분자이지만, 양이온성 펩타이드와 핵산물질 사이의 전하 복합체를 형성해서 입자와 같은 구조를 형성한다. 때문에 이들은 착물 입자와 유사한 성질을 나타내며, 높은 양전하 밀도 때문에 낮은 용해도를 나타낸다. 항체 단편 대신 단백질 결합이 용이하고, 생산이 쉽고, 높은 안정성을 나타내며, 변형이 쉬운 스캐폴드를 이용하기도 한다. Designed Ankyrin Repeat protein fusion protein (DARPin)과 protamine을 이용한 시스템은 항원 양성 세포에 특이적인 유전자 침묵을 유도하였다.

자가다중화 단백질의 재조합 기술로 proteinticle이라 부르는 입자를 만들 수 있다. 세포침투 펩타이드, 표적지향 펩타이드, 올리고뉴클레오티드 결합 도메인으로 이뤄진 융합단백질이 종양 특이적인 siRNA의 전달에 사용되었다. EGFR, vimentin 표적 펩타이드의 사용은 in vitro에서 종양세포 내 세포 흡수와 유전자 침묵을 나타냈다. Proteinticle 자체는 12nm 정도의 균일한 입자크기를 갖지만, siRNA와 복합체를 이루면서 크고 불균일한 입자형태로 응집된다. 핵산결합도메인이 표면에 위치하기 때문에 핵산물질은 작은 proteinticle의 다중화를 유도한다. 결과적으로 표적지향 펩타이드는 응집체 내부에 은폐되어 수용체결합에 사용될 수 없게 된다. In vivo에서 proteinticle의 장점은 아직 밝혀지지 않았다.

항체-약물 접합체는 의약개발을 위한 매력적인 분자이지만, siRNA의 표적전달에서 보고된 바는 없다. 최근 Genentech 사는 siRNA-항체 접합체에 대한 분석 방법론을 개발하여 보고했지만, 약리학적 데이터는 아직 없다.

이 분야에서의 논문이 적은 것은, 이러한 화합물에서 siRNA의 세포 내 흡수와 세포 내 움직임에 대한 불명확함과 위치 특이적인 접합 생성이 복잡하기 때문일 것이다. 또 다른 단백질 스캐폴드는 변형과, 접합체 생성이 쉽다. 올리고뉴클레오티드는 affibody, anticalin, DARPin과 같은 스캐폴드에 위치특이적으로 접합될 수 있다. 미래에는 이러한 접합체가 다양한 단백질-수용체 상호작용과, siRNA 매개 유전자 침묵을 위해 활용될 것이다.

2.6 나노입자 약물 전달 시스템

거대분자 전달 시스템은 핵산물질의 캐리어로써 다양한 멀티컴포넌트 거대분자 전달 시스템이 개발되고 평가되었다(그림 1). 지질입자, 양이온성 고분자(PEI, chitosan, polyamine 등), 양이온성 펩타이드 등이 주류를 이룬다. 구성요소의 구조, 조성, 캡슐화 또는 복합체 형성 방법 및 비율 등의 파라미터가 조절하여 최적화함으로써 이들의 효과를 증가시키고 독성을 감소시킬 수 있었다. 원래 상태의 이러한 시스템은 수동적인 타겟팅에 의존하여 전달된다. 앞서 언급한 바와 마찬가지로, 입자 크기와 표면 조성에 따라 불가피하게 높은 신장, 간, 비장 축적을 나타내며, 다른 조직이나 기관으로는 극히 낮은 농도로 존재한다. 어떤 경우에는 EPR효과가 종양 내 축적을 촉진한다.

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그림 1. 표적능 siRNA 나노입자의 여러 가지 방법에 대한 도식.
올리고뉴클레오티드는 양전하를 띤 고분자중합체, 지질과 복합체를 이루거나, 중성의 리포좀, 나노입자 속에 캡슐화된다. 복합체는 추가로 지질막으로 캡슐화될 수도 있다. 표적에 전달되기 위한 리간드는 반응성 표면이나 지질막의 변형된 구성성분을 이용하거나, 또는 조립 후 생체접합(bioconjugation)에 의해 표면에 이식된다. 종종 PEG화(PEGylation)는 비특이적 상호작용을 감소시키기 위해 사용된다.

리간드가 첨가되지 않은 중합체 중 일부는 간 이외의 다른 기관으로 상당한 전달을 나타내기도 하였다. PEI는 유전자 및 올리고뉴클레오티드 전달을 위한 캐리어로써 오랫동안 연구되었다. PEI와 핵산물질은 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 이루며 응축된 입자를 이룬다. PEI는 길이와, 분기정도, 변형의 존재 등에 따라 다양한 고분자이다. 일반적으로 고분자의 분자량이 증가할수록 우수한 세포 내 흡수를 나타내지만, 독성도 높다. 최근, epoxide 변형된 pentadecane과 PEI600 아민을 14:1로 반응시켜 지질중합체 하이브리드가 생성되었고, 조직에서의 약리학적 효과가 평가되었다. siRNA와 고분자, PEG2000-C14가 응축되어 만들어진 입자는 마우스 모델에서 간세포 유전자 발현에는 영향을 주지 않고, 혈관내피세포에서 유전자 침묵에 효과가 있는 것으로 나타났다. 비슷하게 PEI가 포함된 입자를 사용했을 때와 다르게 예상치 않게 효율적이었다. 내피세포를 표적하는 것에 대한 분자적인 이유는 모르지만, 혈청 단백질과의 독특한 상호작용 프로파일에 의해 나타날 수 있다고 추측하고 있다.

이러한 일부 연구결과에도 불구하고, 간에 축적되는 것을 막기 위해 리간드를 사용하는 것이 필수적으로 보인다. 이는 전달시스템을 더 복잡하게 만든다. 리간드는 전달시스템의 각 구성요소에 부착될 수 있다. 예를 들면, 지질성분 중 하나에 부착하여 리포좀을 이루도록 할 수 있다. 이런 방법은, 재현성있게 리간드-캐리어 생체접합체를 얻을 수 있지만, 입자의 형성에 관한 물리화학적 파라미터들이 달라질 수 있고, 입자의 표면에 적절하게 노출되지 않아 수용체 결합 능력이 감소될 수도 있다.

표적능을 갖게 하는 분자는 올리고뉴클레오티드 캐리어가 형성된 후에, 표면의 반응성 작용기에 추가될 수도 있다. Thiol-maleimide, amide-active ester 커플링, click chemistry alkin-azide cycloaddition 등 많은 수의 부착 방법이 가능하다. 이러한 전략은 간단한 반면, 입자표면의 반응기와 부착반응의 효율에 따라서 리간드의 밀도가 달라질 수 있다. 수용체의 결합과 세포 내 함입에 충분하지 않은 리간드 밀도로 다음 단계로 진행하기 힘들 때가 종종 있다. 대부분의 경우, 전달입자의 외부표면에 여러 개의 리간드가 제시될 것이다. 때문에 입자의 결합력은 높아지고, 다시 떨어지는 속도는 낮아진다. 이는 다른 수용체(리간드에 대한 낮은 친화력을 갖는)에 결합하는 것도 가능하다는 것을 의미한다. Transferrin 수용체를 예로 들면, 높은 결합력으로 인해 라이소좀에 의한 분해가 증가되거나 미세혈관구조에 포획되는 양상을 보인다. BBB를 통과하여 뇌조직 쪽에서 떨어져 나오는 성공적인 트랜스사이토시스를 위해서 transferrin의 적절한 양이 결정적이다.

리간드의 존재가 표적세포에서 수용체 매개 엔도사이토시스를 통한 세포흡수와 저류를 증가시킬 수 있지만, 초기 조직분포에는 특이적인 영향을 미치지 않는 다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 혈액 내 반감기와 혈관 밖으로 나와 조직으로 전달되는 것은 거의 입자의 크기와 입자표면의 생리화학적 특성에 의해서만 결정된다. 나노입자는 간, 신장, 비장에서 가장 높은 비율로 발견되며, 종양조직으로의 축적은 종양 근처 혈관내피세포의 성질에 의존한다. 나노입자가 항원을 발현하는 세포에 다다를수 없다면, 의도했던 효과는 전혀 나타나지 않을 것이다. 또는 리간드를 추가하거나 해서 나노입자 표면을 기능화시키는 것은, 물리화학적 파라미터를 변화시키고 목표한 조직에서의 축적 감소를 일으킬 수도 있다.

표적능을 가진 나노입자가 종종 예기치 않게 낮은 성능을 보이는 것은, 생체분자 코로나(biomolecular corona)라 불리는 입자표면 주위의 혈청생체분자의 접착 때문일 수도 있다. 초기 생체분자 코로나는 거의 단일분자층 형태를 이루는데, 나노입자의 성질과 주변 특정 생체분자의 양에 따라 코로나의 조성도 달라진다. 단백질들로 구성되지만 지질과 같은 다른 분자들도 존재한다. 초기 코로나층 위로 일정한 분자교환이 일어나고 있는 더 동적인 2차 코로나층이 생성되는 것으로 여겨진다. 생체분자 코로나는 나노입자의 성질을 주변 환경에 따라 변화시키게 된다. 부착된 생체분자는 약동학적인 특성에도 영향을 미칠 수 있고, 리간드의 적절한 결합을 방해할 수 있다. 표면의 PEG화(PEGylation)는 일반적으로 생체분자 코로나의 형성을 감소시켜서, 본래의 나노입자의 성질을 유지시키는데 중요하다.

2.7 표적지향 약물전달을 위한 생체접합체(Bioconjugate)

siRNA 접합체는 단일 분자로써 나노입자에 패키징된 것과는 매우 다른 성질을 갖는다. 신속한 분해를 피하기 위해서 siRNA 구성요소는 2’-O-methylation, 2’-fluoridation 등의 화학적 변형이 필요하다. 부착된 리간드의 크기에 따라서 신장 배설이 위협이 될 수도 있다. 이는 PEG화(PEGylation)와 같은 방법으로 분자 크기를 키움으로써 막을 수 있다. 입자를 이용한 방법과 다르게 생체접합체는 혈관내피세포의 구멍 등에 의존하지 않기 때문에 기관으로의 분포는 쉽게 이뤄진다. 간에서의 흡수와 축적을 더욱 증가시키기 위해서 지질, 스테로이드, 토코페롤, 탄수화물과 같은 리간드가 사용되었다(그림 2). GalNAc 플랫폼의 성공을 고려할 때, 다른 기관에서의 흡수와 축적을 증가시키는 방법이 개발되지 않은 것이 놀랍다.

소분자 리간드의 경우 올리고뉴클레오티드를 합성할 때 삽입된 적절한 링커를 통해서, 상대적으로 쉽게 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥에의 3’, 5’ 말단에 접합될 수 있다. 부착 방법은 리간드에 따라 선택되어 사용될 수 있다. 펩타이드 접합체의 경우, 올리고뉴클레오티드와 펩타이드가 각각 따로 합성된 후 연결하거나, 또는 단계적인 고체상 합성(solid-phase synthesis)을 이용할 수 있다. 펩타이드의 길이가 길어질수록 보호기 등이 요구되는 고체상 합성 방법은 더 복잡해진다.

RNAi 복합체를 활성화시키기 위해서는 siRNA가 캐리어로부터 유리되어야만 한다. 따라서 엔도좀의 산성 환경에서는 절단 될 수 있도록 고안된 불안정한 결합이 유리한 것으로 간주된다. 하지만 이러한 과정이 세포 내에서 어떻게 일어나는지 정확하게 알려지지 않았기 때문에, 표적능을 위한 리간드가 반드시 절단될 필요가 있는지는 불명확하다. 또한 캐리어 자체에 의존적일 수도 있다. 예를 들어, 3가 GalNAC 접합체는 안정적인 결합에도 불구하고 효율적인 유전자 침묵을 전혀 방해하지 않았다.

다가 결합은 여러 개의 표면 수용체에 동시에 결합할 수 있기 때문에 세포결합과 흡수능력이 종종 우수하게 나타난다. 이를 위해서는 리간드 간의 거리 및 공간적 배열이 중요하다.

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그림 2. 생체접합체 기술 및 리간드 구조의 개관.
올리고뉴클레오티드에서의 부착지점은 주로 3’- 및 5’- 말단의 수산화기가 있는 곳이 된다. 가장 많이 쓰는 결합유형은 엔도좀에서 분해될 수 있는 불안정한 링커인 이황화결합 및 안정적인 연결을 위한 click 화학에서 유래한 maleimide 또는 triazole 결합이다.

3. 결론

siRNA 전달 시스템에 대한 10여년의 연구개발은 중요한 파라미터가 무엇인지 등 많은 교훈을 남겼다. 나노입자의 효능은 그 크기에 크게 의존하고, 입자의 재료와 표면의 특성도 중요하다. 최적화된 입자크기는 신속한 배설(작은 입자의 경우)을 방지하고, 세망내피계로부터 제거(큰 입자의 경우)를 피하기 위해 중요하다. 입자 재료에 따라 다르지만, 최적의 크기는 약 50-200nm로 확립되었다. 다공성은 물의 침투와, 그에 따른 방출 및 분해에 중요한 쟁점이 된다. 표면의 PEG화(PEGylation)는 입자가 면역세포에 포획되어 면역계를 활성화 시키는 것을 방지하지만, 일반적으로 세포흡수와 세포 내 유리를 감소시킨다. 양전하는 세포와의 결합을 증가시키고, pH 완충능력을 통해 엔도좀 시스템을 붕괴시킴으로써 세포 내 전달을 증가시키는 것으로 생각되지만, 면역 세포와의 비특이적인 상호작용을 증가시켜 독성을 유발하기도 한다.

이러한 성질들은 나노캐리어를 디자인하는데 도움이 되지만 모든 곳에서 적용되지는 않는다. 면역원성 및 독성 효과는 대게 예측할 수 없으며, 기능을 위한 성공적인 전달 정도는 종종 놀랄 만큼 낮다. 좀더 합리적인 디자인을 위해서는 정확한 세포 내 흡수과정과, 세포 내 움직임, 엔도좀 분류 구분 등에 관한 더 많은 지식이 필요하다. 수용체 매개 흡수를 이용할 때는 고친화력 리간드를 이용한 생체접합체를 통해 표적 조직이나 기관 축적이나 특이적인 세포와의 결합을 증가시킬 수 있다. 나노캐리어 입자와 유사하게, 세포질 내로 전달되는 정도는 엔도좀탈출과 엔도좀 분류 구분에 크게 의존한다. 라이소좀 분해정도와 기능적인 흡수를 증가시키기 위한 전략을 찾고, 최적의 수용체와 그에 상응하는 리간드를 찾기 위해서는 더 자세한 연구들이 필요하다.

학술적 연구와 실제 치료 적용 사이의 괴리도 존재한다. 학술적 나노기술 연구는 흡수 기전에 대한 최신의 식견을 얻기 위해서 복잡한 최첨단시스템을 개발하는 경우가 많다. 이러한 정교한 시스템은 제작방법, 특성화 방법, 독성 등의 문제로 인해 실제 임상환경에 적용될 가능성은 거의 없다. 좀더 단순화된 해결방법이 doxorubicine이나 paclitaxel 약물요법을 향상시키고 시장 승인을 따냈지만, 생체거대분자의 전달에도 적용될 가능성은 적다.

siRNA 전달의 경우, 두 가지 방법이 성공적으로 전임상단계와 조기임상단계의 시험을 받는 중이다. SNALPs (lipid particles designed for nucleic acid, 핵산을 위해 설계된 지질분자) 캡슐 내에 담는 방법과 asialoglycoprotein 수용체 리간드인 N-acetyl galactosamine 접합체를 이용한 방법이 있으며, 두 가지 방법 모두 간을 표적으로 한다. 여기에서부터 출발하여 수용체 리간드를 전환하는 방법으로 siRNA 요법을 다른 장기로 확장시킬 수 있을 것이다. 지질입자를 진보시키는 것은 더욱 복잡하다. 지질친화성 및 입자크기 모두에 의해서 간 축적이 유발되기 때문이다. 표면의 특성은 구조적 변형(PEGylation, 타겟팅 부위의 부착)을 통해 조절될 수 있지만, 입자의 크기 때문에 치밀한 내피세포접합을 갖는 조직은 모두 배제되고 여전히 간으로 축적을 일으킬 것이다. 더 효과적인 나노입자의 표적화 전략이 개발되면 획기적인 발전이 이뤄질 수 있을 것이다.

siRNA 전달 시스템에 대한 세포 내 흡수와 세포 내 움직임에 대한 기초적인 기전의 이해와 구조적 및 생물리학적 요구조건에 대한 이해가 증진됨에 따라 가까운 미래에 이 분야에서의 획기적인 발전이 예상된다. 향후 10년 동안의 임상현장으로의 성공적인 적용과 그에 따른 임상적 결과는 siRNA 치료법의 앞으로의 파장을 결정할 것이다.

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박근우(2017). 간(liver)을 넘어서: siRNA 치료제 표적 전달 분야의 진척상황과 도전과제. BRIC View 2017-R06. Available from http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=2691 (Feb 28, 2017)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
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