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최근 신경과학 연구에 사용되는 신경세포 활성 조절기법 소개
최근 신경과학 연구에 사용되는 신경세포 활성 조절기법 소개 저자 허수희 (솔라루체, 광생물학연구소)
등록일 2019.05.30
자료번호 BRIC VIEW 2019-T15
조회 1110  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
인간과 관련된 여러 학문, 철학, 심리학, 인지과학, 경제학 등은 사람의 내재적 특징을 파악하는데 그 목적을 두고 있다. 사람이 어떻게 외부환경을 인식하는가 에 대한 질문은 인간에 대한 이해를 돕고 인공지능과 로봇과 같은 응용 분야에 적용할 수 있고 사람들 개인에게서 드러나는 공통 심리 혹은 대중심리를 경제 및 정치에 어떻게 활용할 것인가 하는 질문은 현대를 살아가는 많은 이들의 공통관심사이다. 사람을 향하는 뇌과학의 본질적 질문들은 뇌의 정보처리를 담당하고 있는 신경세포의 역할 규명을 통해 답을 내릴 수 있을 것이다. 신경세포 활성 조절은 감각, 움직임, 감정, 언어, 인지, 지각 등과 관련된 신경세포의 역할을 규명하는 데 유용한 기술이다. 본 동향 보고서에서는 전기, 빛, 합성물, 초음파 등으로 신경세포 활성을 조절하는 기법들의 작용원리와 종류 그리고 한계점을 소개하고 있다. 또한 연구에 도움을 주기 위해 맺음말에서는 신경세포 조절 기법에 대한 정보를 얻을 수 있는 유용한 웹사이트들 또한 제공하고 있다.
키워드: brain, neuron, electrical stimulation, optogenetics, chemogenetics
분야: Neuroscience, Genetics

목차

1. 들어가는 말
2. 중심 내용
  2.1 신경세포 활성의 기본원리
  2.2 전기자극을 이용한 신경세포 활성 조절기법
  2.3 광유전학을 이용한 신경세포 활성 조절기법
    2.3.1 광유전학이란?
    2.3.2 신경세포 활성조절에 이용되는 광단백질들
    2.3.3 옵신 타겟팅 전략
    2.3.4 광유전학의 다양한 활용방법
  2.4 화학유전학을 이용한 신경세포 활성조절기법
    2.4.1 DREADDs의 작용원리
    2.4.2 DREADDs의 종류
    2.4.3 DREADDs의 활용
  2.5 신경세포 활성 조절을 위한 다양한 접근
    2.5.1 광유전학과 화학유전학의 상보적 사용
    2.5.2 신경세포 활성 조절을 위한 다양한 접근법
3. 맺음말
4. 참고문헌


1. 들어가는 말

‘생각한다. 고로 존재한다’ 데카르트의 존재에 대한 고찰에서 알 수 있듯이 우리는 존재하는 동안 외부의 정보를 받아들이고 생각하고 처리하여 적절한 반응을 한다. 이러한 과정은 한가지 순차서열을 지니는 듯 보이지만 실제로 우리는 동시다발적으로 많은 정보에 노출되어 있으며 다수의 반응을 동시에 한다. 일례로 필자가 키보드를 치는 중에도 모니터에 보이는 문자와 그림들, 멀리서 들려오는 음악소리, 키보드에 닿는 손가락의 느낌, 누군가 마시고 있는 커피향기 등의 자극에 노출되어 있으며, 어떤 내용을 이어 나가야 할지에 대한 고민, 지금 이 노래는 어떤 노래였더라, 어제 먹은 저녁에 아직도 배가 부르네 하는 순간순간을 스치는 생각들 그리고 손가락의 움직임과 눈동자의 움직임 등의 반응이 한순간에 이뤄지고 있는 것이다. 우리는 어떻게 이 많은 정보를 받아들이고 처리하고 반응하고 있을까? 사람들은 인간의 신비, 더 자세히는 뇌의 신비에 흥미를 보여왔다. 최근 뇌과학에 대한 대중의 관심이 쏟아지면서 ‘뇌’관련 질문을 담은 다양한 서적들이 발간되고 있으며, '사람이란 무엇인가?', '인간을 닮은 인공지능이란 무엇인가?' 등의 뇌과학의 본질적인 궁금증에 대한 해답이 요구되고 있다.

뇌는 크게 신경세포와 신경교세포로 구성되어 있으며 그 중 신경세포는 뇌 만이 수행 할 수 있는 독특한 기능인 정보처리를 담당하고 있는 것으로 알려져 있다. 정보전달과 관련한 신경세포의 활성을 이해하는 것은 뇌기능을 이해할 수 있는 핵심 부분으로 신경세포의 활성을 조절하는 방법을 적용한다면 깊은 이해를 도출할 수 있다. 이를 위해 전기자극(electrical stimulation), 광유전학(optogenetics), 화학유전학(chemogenetics) 기법 등의 다양한 기술들이 연구되고 있다.

본 동향보고서에서는 고전적인 신경세포 활성 조절기법에서부터 새로운 패러다임에 이르는 다양한 신경세포 활성 조절기법을 소개하고자 한다.

2. 중심 내용

2.1 신경세포 활성의 기본원리

뇌를 해부함으로써 뇌의 구조에 대한 상당히 자세한 지식이 얻어지고 있다. 인간의 뇌는 수 천억개의 신경세포(neuron)로 구성되어 있음이 밝혀졌다. 신경세포는 전기 펄스로 표현되는 정보를 받아들여 다음 신경세포로 전달하는 전기적 회로망을 구축하고 있지만, 신경세포끼리의 정보전달은 신경전달물질이라는 화학물질을 사용한다. 현재까지 밝혀진 신경세포의 반응원리를 살펴보면, 대부분의 신경세포는 전기적 흥분성을 지니고 있으며 이러한 세포의 성질은 그 세포막 또는 생체막에 존재하는 다양한 종류의 이온채널의 활성에 의해 조절되는 것으로 알려졌다. 단일 신경세포의 구조는 수상돌기(dendrite), 체세포(soma), 축색돌기(axon)으로 크게 나뉘며, 신경세포의 수상돌기로 전달된 전기적 신호는 세포의 체세포를 거쳐 축삭원추(axon hillock) 부위에서 통합되어 축색돌기에서 전기적 신호발생 여부가 결정된다. 축색돌기를 통해 신경말단부위로 전달된 전기적 신호는 신경전달물질의 분비를 유도하는데, 이때 세포막 전압에 의해 조절되는 전압의존성 이온채널(voltagegated ion channels)의 활성조절이 가장 중요한 역할을 한다. 하지만 이온채널의 활성은 세포막 탈분극에 의한 전위차뿐만 아니라 세포막에 존재하는 신경전달물질이나 호르몬의 수용체들에 의해서도 동시에 조절된다.

2.2 전기자극을 이용한 신경세포 활성 조절기법

1875년 Richard Caton는 갈바노미터를 사용하여 노출된 동물의 뇌에서 전류를 검출한 이래로 전기적 자극을 통해 신경세포활성 조절기술이 적용되었다. 초기에는 무작위적으로 전극을 꽂아 살아있는 뇌의 일부를 자극하였고 이 기술은 특정 행동이나 인지와 같은 상황에서 특정 신경회로만을 자극하는 것으로 발전하였다. Fritsh 와 Hitzig는 개의 뇌를 이용하여 전기적 자극을 유도하였으며 Sherrington과 Penfield를 비롯한 과학자들은 영장류의 움직임을 관장하는 대뇌피질 (motor cortex)을 전기적으로 자극하여 신경세포 활성을 조절함으로써 대뇌피질의 운동영역 조절의 원리를 이해하고자 하였다 [1-3].

우리의 뇌는 어떻게 지각하고 인지하는가를 탐구하기 위해 Penfield는 간질 치료나 종양 제거를 위한 수술 동안 환자에게 전기적 자극기법을 시도하였다 [3]. 이러한 사람을 대상으로 한 연구는 주로 일차적 치료가 요구되는 상황에서만 가능했다. 그렇기 때문에 깨어있는 원숭이(Fhesus monkeys)를 대상으로 인지와 지각에 대한 연구가 중요하게 수행되었다. 원숭이들은 감각자극과 전기자극이 주어지는 상태로 훈련되었으며 이러한 연구들은 전기생리학적으로 분류된 신경세포들이 어떻게 지각에 영향을 주는지에 대한 실마리를 제공하였다 [4-7].

연구를 목적으로 사용된 전기자극기법은 치료용으로도 적용되었다. 뇌심부자극술(deep brain stimulation; DBS)이 치료목적으로 적용된 전기자극기법의 대표적인 예이다. 뇌심부자극술은 1997년 미국 식약청의 승인을 얻은 이후 진전, 파킨슨병, 근긴장이상증, 강박증과 같은 다양한 뇌질환의 환자에게 적용되어 왔다. 뇌심부자극술은 자극이 가해진 뇌심부핵의 출력을 증가시켜 흥분성과 억제성의 동시 복합적인 효과를 통해 주위 신경섬유를 활성화 시켜 기저핵과 사상피질 회로(basal thalamocortical tract) 전반을 조절하는 것으로 이해되고 있다 [8].

비교적 정확하고 비침습적인 전기자극기법인 TMS (Transcranial magnetic stimulation)는 영장류뿐 아니라 사람에게도 적용되고 있다. 최근 TMS는 기존 항우울 약제에 효과를 보이지 않는 우울증 환자를 대상으로 신경을 자극하여 우울증의 증상을 호전시키는 데 사용되고 있다. 치료용 TMS는 반복적인 마그네틱 펄스를 제공하기도 하는데 rTMS (repetitive TMS)로 불리기도 한다.

보다 정확한 전기자극기술을 위해서는 기능에 근거한 해부학적 뇌지도가 정립되어야 하며, 뇌의 직접적인 전기자극은 지각 또는 행동에 대한 측정 가능한 영향을 주었다는 것은 의심할 여지가 없다. 하지만 전기자극의 경우 신경세포 활성 촉진에는 용이하지만, 억제에는 효과적이지 않는 한계가 있어 광유전학 기법이나 화학유전학 기법과 같은 다른 신경활성 자극기법들이 제시되었다.

2.3 광유전학을 이용한 신경세포 활성 조절기법

뇌의 기능을 보다 심도 있게 탐구하기 위해서는 새로운 질문을 위한 힘을 길러야 한다. 다시 말해, 우리는 새로운 기술이 필요한 것이다. 우리의 뇌가 진짜 하는 일이 무엇인지를 추정하기 위해 신경과학자들은 정확한 타이밍(ms 단위로)에 정확한 신경세포 군집(특정 회로에 연결되어 있는)을 자극해야 한다. 일찍이 1979년 노벨상을 탄 과학자인 Francis Crick은 한 종류의 신경세포를 통제하는 기술의 필요성을 역설하였고 기존의 전기자극기술은 전극이 너무 투박하여 다른 신경세포 타입을 구별하지 못한 채 전극에 닿은 모든 부위를 자극했으므로 이러한 문제를 해결하지 못하는 어려움이 있었다 [9]. 또한 전기자극 자체만으로는 신경세포의 활성을 꺼트려 신호전달을 막지 못하였다. Francis Crick은 훗날 빛으로 자극한다면 정확한 시간과 위치에 특정 신경세포를 자극할 수 있을 것으로 예상하였다 [10]. F. Crick의 예측으로부터 40년 전쯤에 생물학자들은 가시광선에 반응하여 세포막의 전위차를 형성시키는 미생물에서 특정 단백질의 기능을 밝혀졌다. 이 단백질들은 “옵신(opsin)” 유전자에서 발현되었는데 이는 미생물이 빛으로부터 에너지와 정보를 얻는 데 도움을 주는 용도로 생각되었다. 1971년 Walther Stoeckenius 와 Dieter Oesterhelt는 단일 이온 펌프로 작용하는 bacteriorhodopsin이라는 단백질을 발견하였고 이 단백질은 녹색 빛의 양자에 의해 일시적으로 활성화되는 특징이 있었다 [11]. 이 발견 이후, 1977년에는 halorhodopsin이 2002년에는 channelrhodopsin이 동정되었다 [12-14]. F. Crick의 추측은 현실화될 준비가 되어있었던 것이다!

2.3.1 광유전학이란?

광유전학(Optogenetics)은 유전체학과 광학의 조합으로 살아있는 조직의 특정 세포를 잘 통제된 조건 하에서 자극하는 것이 가능하게 했다. 하지만 이를 위해서는 빛에 반응하는 특정 단백질을 세포에 발현시키는 것이 필수적이었으며, 뇌로 빛을 전달하는 기기의 개발과 빛 자극의 조절 방법 등이 정립되어야 했다. 2005년도에 스텐포드 대학의 Karl Deisseroth와 과학자들은 신경과학 분야의 오랜 숙제였던 정확한 시간에 특정 신경세포 군을 활성화시키는 기법인 광유전학 기법을 발표한다 [15]. 광유전학 기법의 발표는 가히 신경과학계의 반향을 불러일으켰다. 광유전학 기법 관련 논문들이 기하급수적으로 늘어났으며 (그림 1) 2016년 세계경제포럼(world economic forum)은 10대 유망 기술 중 하나로 광유전학 기법을 꼽았으며, 신경과학 분야를 넘어서 암을 비롯한 신체적 질환에도 적용하는 움직임이 일고 있다.

 

광유전학 기법 관련한 논문 수
그림 1. 광유전학 기법 관련한 논문 수
(출처: Pubmed, 자료 확인일: 2019-03-16)

 

수천 명의 과학자들은 이제 광유전학 기법의 적용을 넓혀 벌레, 물고기, 초파리, 마우스, 렛트, 그리고 원숭이에 이르기까지 다양한 동물군에서 행동과 학습을 연구하고 있고 이때 발생되는 신경세포군의 활성 패턴을 연구하고 있다. 앞서 언급했듯이 광유전학 기법은 특정 신경세포군만 정확한 시간에 선택적으로 자극하기 때문에 광단백질의 종류, 옵신의 선택적 타겟팅, 그리고 빛 자극을 위한 기기들이 중요한 기술로 개발되었다. 지난 10년간 개발된 광유전학 기법의 핵심기술들을 자세히 소개하고자 한다.

2.3.2 신경세포 활성조절에 이용되는 광단백질들

일부 조류와 미생물들은 가시광선에 반응하는 옵신이라 불리는 광단백질을 이용하여 생존한다. 옵신은 세포막의 전기적 전하를 띠는 이온의 흐름을 조절함으로써 환경에서 에너지를 추출할 수 있도록 도움을 준다. 옵신의 종류에 따라 빛에 대한 감수성과 작용기능이 다양하다. 옵신의 종류에 따라 활성촉진과 활성억제 효과가 나타날 수 있다.

① Major classes of opsins: channelrhodopsin (ChR)은 청색광에 반응하여 비특이적인 양이온 채널로 신경세포 활성을 촉진한다. 반면에, halorhodopsin (NpHR)과 bacteriorhodopsin (BR)은 각각 황색광과 녹색광에 반응하여 염소이온을 세포 안으로 유입하거나 수소이온을 세포 밖으로 유출시켜 신경세포 활성을 억제한다 [16]. 최근 구조 기반 돌연변이 기법을 ChR에 적용하여 염소이온을 세포 안으로 유입하는 ChR 변이체를 개발하였다 [17].

② Kinetic opsin variants: 빛에 보다 빠르게 반응하는 ChR 변이체들이 개발되었다. 그 예로 ChETA, ChIEF, Chronos 들을 들 수 있는데 이 변이체들은 최대 200Hz 이상 신경세포발화를 유도할 수 있는 것으로 확인되었다.

③ Step-function opsins: 빛을 오랜 시간 동안 세포에 노출시키면 세포사멸이 일어나기 때문에 짧은 빛에 세포활성조절을 길게 유도하는 옵신들이 개발되었다. 청색광에서 신경세포 활성을 촉진할 수 있으며 황색광에서는 활성이 억제되는 옵신(SSFO: stabilized step function opsin), 염소이온을 투과하는 channelrhodopsin (SwiChR) 들은 짧은 빛 노출에도 채널 변화가 유지되어 옵신의 기능이 안정화된 변이체들이다 [18, 19]. 이 옵신 변이체를 이용하여 유도한 신경세포 활성 조절은 시간이 지나거나 특정 조건에서 세포활성이 원상 복귀되기 때문에 신경세포의 전기생리학적 감수성, 막전위, 세포막의 내부저항 등의 특성이 크게 달라지지 않고 신경세포 활성을 조절할 수 있는 장점을 지닌다 [18, 20].

④ Red-shifted excitatory opsins: 신경세포 활성을 조절하는 경우 신경세포 회로가 행동이 필수적인지 필요조건 인지 여부를 확인하는 것은 뇌기능을 이해하는 데 매우 중요하다. Functional MRI, 칼슘이미징, 전기생리학적 레코딩 등의 기법을 광유전학을 자유롭게 움직이는 동물에 적용하기 위해서는 청색광에 반응하는 옵신들은 부적절하다. 이러한 한계를 극복하기 위해 적색광에 반응하는 옵신들(VChR1, C1V1, Chrimson, ReaChR, bReaChES)이 개발되었다. 적색광에 반응하는 옵신들은 칼슘이미징에 사용되는 GECI (genetically encoded Ca2+ indicator)와 병용할 수 있어 신경세포 활성 조절과 관찰이 한 동물 내에서 이뤄질 수 있게 되었다.

2.3.3 옵신 타겟팅 전략

옵신을 뇌의 특정 부분이나 특정 세포에만 발현시키는 타겟팅 전략은 광유전학 기법의 최대장점이다. 바이러스 종류, 세포 특이적인 프로모터, 재조합효소(recombinase) 가 도입된 동물, 그리고 해부학적 위치선정 등의 방법을 통해 타겟팅 전략을 세울 수 있다. 옵신 타겟팅 전략은 여러 장점이 있다. 첫 번째로 신경세포 활성 억제는 타겟하지 않은 신경세포 주변이나 신경세포 이전의 신경회로망에 영향을 미치지 않으므로 타겟으로 한 신경망 회로의 역할에 대해 비교적 정확한 정보를 제공하며 두 번째로는 신경세포의 발화는 신경정보 유입의 단순한 합이 아니라고 생각되기 때문에 신경세포 활성 억제 또는 촉진으로 얻어지는 결과로 신경세포들의 정보처리에 대한 이해를 넓히는 데 도움이 된다.

① 바이러스 종류: Recombinant adeno-associated virus (rAAV), Lentivirus (LV), Canine adeno virus (CAV), retrograde rAAV (rAAV-retro), Pseudo rabis virus (PRV), Herpes simplex virus (HRV), Vesicular stomatitis virus variant (VSV) 등이 사용된다. 그중 AAV와 LV가 상대적으로 안전하고 신경세포와 같은 분열하지 않는 세포에 들어갈 수 있기 때문에 가장 많이 사용된다. 하지만 AAV와 LV는 각각 5Kb, 9Kb 정도의 유전자만을 담을 수 있기 때문에 긴 유전자를 도입해야 하는 경우 HRV가 사용된다. 바이러스를 이용해 신경회로망을 선택적으로 타겟팅하는 방법으로 재조합 효소를 발현하는 CAV를 신경세포의 세포체에 투여한 뒤 재조합효소 의존적으로 유전자를 발현하는 옵신을 AAV/LV 등에 넣어 신경세포 축삭이 뻗어 나간 뇌부위에 투여하기도 한다. 또 다른 방법으로 rAAV와 PRV를 이용하면 신경세포의 시냅스 말단에서 세포 내로 (역방향) 유전자를 도입할 수 있기 때문에 조건에 따라 시냅스로 연접해 있는 신경세포로의 도입이 가능하다. CAV-재조합효소와 다른 바이러스의 적용은 두 종류의 바이러스를 투여해야 하므로 실험적으로 어려울 수 있으며 상대적으로 실험적으로 쉬운 PRV의 적용은 바이러스의 독성 때문에 며칠 이내로 실험을 마쳐야 하는 단점이 있다. 새로이 개발된 CAV-N2c (deltaG) RV는 독성이 낮고 타겟팅의 이점을 살리는 것으로 개발되었다 [21]. HSV1-H129 strain과 VSV 변이체는 세포체에서 시냅스 말단 쪽으로 (정방향) 퍼져 시냅스를 건너서 유전자를 발현시킬 수 있는 특징을 갖는다 [22-24].

다양한 바이러스 조합을 이용한 기법 중 하나로 TRIO (tracing the relationship between input and output)가 소개되었다. TRIO는 CAV-Cre, 재조합효소 의존적으로 원하는 유전자를 발현하는 AAV, 재조합효소 의존적으로 G 단백질을 발현하는 AAV, RV (deltaG)를 적용하여 신경회로망을 밝히는 기술이다. 예를 들어 A 부위에서 정보를 받아 (input) C로 보내는 (output) B에 위치한 신경세포만을 타겟팅 하려면 재조합효소를 발현하지 않는 일반 동물의 C 부위에 CAV-Cre를 투여하고, B 부위에 재조합효소 의존적으로 원하는 유전자를 발현하는 AAV, 재조합효소 의존적으로 G 단백질을 발현하는 AAV 와 RV (deltaG)를 투여하여 정확한 input과 output에 연결된 신경세포를 타겟팅한다 [25]. 하지만 TRIO 기술로도 C 이외에 다른 부위(예를 들어, D)에 output이 연결된 신경세포를 구분할 수 없다. 이 경우 재조합효소를 여러 개 사용하면 되는데, Cre 재조합 효소를 발현하는 동물에 Cre 재조합효소 의존적인 CAV-Flp, Flp 의존적으로 발현하는 유전자를 가진 AAV, Flp 의존적으로 발현하는 G 단백질 유전자를 가진 AAV, RV (deltaG)를 적용하면 A에서 정보를 받아 C에만 전달하는(D에는 전달하지 않는) B에 위치한 단일 input-output 신경세포들을 타겟팅할 수 있다. 이 방법을 cTRIO (cell-type specific TRIO)라 부른다. 다양한 바이러스의 적용은 옵신의 도입을 빠르고 강력하게 하기 때문에 해부학적 구조와 기능을 밝히는 데 유용하다 [25-27].

② 세포 특이적인 프로모터: 타겟 세포의 프로모터를 활용한 전사(transcriptional targeting)는 특정 세포에서만 도입 유전자가 발현되도록 한다. 하지만 프로모터들마다 활성이 다르므로 도입 유전자의 발현 정도가 중요한 경우 프로모터 활성을 확인해야 한다. 신경과학 연구에서 주로 사용되는 프로모터들은 아래와 같다 (표 1).

 

표 1. 신경세포 활성 조절에 사용되는 프로모터와 세포특이성
신경세포 활성 조절에 사용되는 프로모터와 세포특이성

 

③ 재조합효소: 프로모터를 이용한 세포타입 타겟 전략은 프로모터의 활성이 낮아 도입유전자가 잘 발현되지 않거나 프로모터가 너무 길어 바이러스 패키징의 어려움 등의 문제로 적용의 한계가 있다. 재조합효소 의존적인 옵신발현은 이러한 한계를 극복하는데 상당히 도움이 된다. 예를 들어, 잘 사용되고 있는 일반적인 프로모터인 Ef1a 같은 프로모터에 재조합효소가 반응하는 유전자 서열을 삽입하여 바이러스 패키징한 뒤, 재조합효소를 발현하는 바이러스를 함께 투여하거나 유전자조작으로 재조합효소를 발현하는 동물에 바이러스를 투여하는 방법을 적용할 수 있다. 이 방법은 바이러스가 투여된 부위의 재조합 효소를 발현하는 세포에만 선택적으로 유전자를 강력하게 발현시킬 수 있다. 수백개의 Cre 또는 Flp, Dre 재조합 효소를 발현하는 마우스라인을 이용할 수 있다. 이와 같은 방법을 이용한 사례로는 대뇌피질의 parvalbumin 발현 interneuron 의 활성을 광유전학 기법으로 동물의 사회적 행동 조절과 관련 있음을 밝혔으며 [19] septum에 위치한 콜린성 신경세포가 해마 회로 활성을 조절함이 발표되었다 [28]. 또 다른 전략으로, 재조합효소의 존재 시 유전자 발현이 억제되는 방법이 globus pallidus externa에 위치하면서 전두엽 부위로 뻗어있는 비 콜린성 신경세포의 전기생리학적 특징을 연구하는데 적용되기도 하였다 [29, 30].

재조합효소를 두 종류 이상 이용하면 INTRSECT (INTronic recombinase sites enabling combinatorial targeting) 적용이 가능하다. 예를 들어, Cre 재조합효소 의존적으로 발현하고 Flp 재조합효소 의존적으로 발현하지 않는 유전자서열을 만들면 ventral tegmental area의 도파민성 신경세포만을 타겟할 수 있으며 해마의 parvalbumin과 somatostatin을 동시에 발현하는 interneuron을 타겟할 수도 있다 [31, 32].

④ 신경세포 회로 타겟팅: fiber-optic interface를 이용하여 신경세포의 세포체를 자극하거나 축삭 부위를 자극하면 두 군데 이상의 뇌부위 사이에 연결된 신경회로망을 타겟팅 하는 것이 가능하다. 축삭이 긴 신경세포의 경우 방법의 적용이 어려울 수 있는데, 옵신이 세포 안에 충분히 발현되도록 기다리거나 neuritin 3` UTR (untranslated region)을 넣어 긴 축삭에서도 옵신이 균일하게 발현되도록 하는 것이 좋다 [33]. 뇌의 두 부위에서 이온 환경이 다른 경우 (예를 들어, 염소이온의 교환이나 수소이온의 버퍼링 그리고 수소이온에 의해 발생되는 전류가 다양한 경우) 세포체와 축삭에서 옵신이 다른 영향을 줄 수 있다. 이런 경우 옵신 중 이온 차이에 덜 민감한 염소이온 펌프를 이용하여 신경세포 활성을 억제하는 전략을 추천한다 [20, 34].

2.3.4 광유전학의 다양한 활용방법

광유전학의 적용은 신경세포 활성 기록이 병용되어야 하기 때문에 신경세포활성 측정 방법에 따라 고려할 사항들이 있다. 신경세포 활성 측정 방법은 전기생리학적 레코딩, GECI를 이용한 칼슘이미징, MRI 등이 있다.

가장 많이 사용되는 방법은 전기생리학적 레코딩으로 path-clamp, multiunit extracellular recording, single unit extracellular recording 등의 방법이 있다. Path-clamp는 움직이는 동물에서 측정하기 어렵고 긴 신경회로망의 연결성을 추적하기 어렵다는 단점이 있으나 acute brain slice recording을 수행하여 여러 시냅스 또는 수용체들의 blocker를 처리한 뒤 광학적으로 발생된 단일 시냅스 반응을 측정하기 용이하다. Multi-unit extracellular recording은 선정 부위의 mean spike rate를 측정하기 때문에 비교적 단순한 신경활성과 행동의 원인-결과 관계를 설명할 수 있다. Patch-clamp와 Single unit extracellular recording은 단일 세포를 구별할 수 있기 때문에 옵신을 발현하는 신경세포를 구별할 수 있는데 이 방법을 phototagging이라 한다. 이 방법은 빛에 반응하는 시간(latency 3~5ms 이내), 측정된 waveform의 일관성(low jittering) 등을 지표로 특정 신경세포를 구별하고 신경세포의 전기생리학적 특징을 규명하는 데 이용되고 있다.

신경세포 활성을 실시간으로 판독할 수 있게 되면서 빛 자극을 신경세포 활성의 상태에 따라 조절할 수 있는 closed-loop 광유전학 기법이 발표되었다. 한 연구에서는 간질을 보이는 동물모델을 이용하여 간질이 시작되는 시점을 thalamus와 cortex의 신경세포 활성 측정으로 확인하여 신경세포 활성을 억제하는 빛을 조사하였고 그 결과 간질이 효과적으로 억제됨을 확인하였다 [35]. 이러한 접근은 전기생리학과 광유전학 기법의 정확하고 밀접한 접목의 발견이라 할 수 있겠다.

GECI를 이용한 칼슘 이미징 기법으로 신경세포 활성을 측정하는 경우, 전기생리학적 접근에 비해 시간적 정보력은 떨어지지만 활성화된 신경세포 분포에 대한 공간적 정보를 가장 잘 알 수 있다. 이 방법의 경우 세포 해상도와 동시성을 잘 유지할 수 있으나 많은 수의 신경세포 활성을 측정하려면 광섬유의 폭이 커져 뇌의 물리적 손상을 피할 수 없는 한계가 있다. Fiber photometry로 불리는 신경세포 활성을 군집단위로 측정하는 기법이 소개되었다. Fiber photometry는 보다 단순한 기법으로 같은 동물 내에서 동시에 여러 축삭 구역을 측정할 수 있는 장점이 있다. 하지만 신경세포 하나하나의 활성을 추정하기는 어렵기 때문에 단위 신경세포의 활성을 측정하기 위한 방법으로 confocal/two-photon microscopy를 이용하거나 소형화된 microscopy를 이용하여 신경세포 활성을 측정하기도 한다.

신경세포 활성을 조절하거나 세포 내 칼슘 변화를 동시에 모니터링하는 가장 쉬운 방법은 같은 파장대에서 작용하는 옵신과 GECI를 함께 이용하는 것이다. 비록 이 방법은 신경세포 하나하나를 통제할 수는 없지만 동물의 행동에 빠른 피드백을 주어 다양한 뇌부위에서 동시에 활성자극 및 활성 측정이 가능하기 때문에 연구에 도움이 된다 [36, 37]. 칼슘 이미징과 광유전학 기법을 접목하는 또 다른 예는 wide-field one-photon optogenetic activation이다. Cranial window, cannula, 또는 GRIN lens 등을 통해 단일 세포의 활성을 추적하는 방법이다. 최근 연구에서 spatial light modulator를 이용하여 해마의 단일 place cell을 자극함으로써 place-field activity를 발생시켰다 [38].

이제 광유전학 기법은 행동하는 동안 활성을 띠는 신경세포의 활성 정도와 타이밍을 매칭할 수 있게 되었다. 이것은 IEG (immediate early gene) 프로모터에 기반한 전략을 통해 가능한데 FOS, ARC, 또는 E-SARE와 같은 단백질은 행동을 바꿀 만큼의 신경세포의 활성이 한바탕 일어난 뒤 한 시간 이내에 일시적으로 증가하는 현상을 이용한 것이다. IEG 단백질들의 세포 염색은 광유전학 기법 적용 후 신경세포의 활성화가 실제로 일어났다는 증거로 사용될 수도 있고, IEG 프로모터를 이용하여 옵신을 발현시키면 활성 증가에 기반한 신경세포 선별이 가능하다 [33, 39].

2.4 화학유전학을 이용한 신경세포 활성조절기법

화학유전학이란, 화학유전학은 화학생물학 또는 화학유전체학으로도 불리며 알려지지 않은 저분자 합성물질에 반응하는 단백질을 적용해 세포의 활성을 조절하여 생리학적 기능의 이해를 돕는 응용기술이다. 인산화효소(kinase), 비인산화효소(non-kinase enzyme), GPCR (G protein-coupled receptors), 그리고 ligand-gated ion channel 등의 단백질들이 화학유전학적으로 만들어졌다. 화학유전학적으로 설계된 다양한 단백질들 중 wild type muscarinic receptor를 일부 돌연변이 시켜 acetylcholine (Ach)와의 반응성은 낮추고 새로운 합성물질(예를 들면, clozapine-N-oxide)에 반응성을 높인 DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs)가 가장 많이 사용되기 때문에 DREADDs에 대해 설명하고자 한다 (그림 2).

 

두 ligand의 DREADDs와 wildtype muscarinic recptor에 대한 선택적 활성화를 보여주는 모식도
그림 2. 두 ligand의 DREADDs와 wildtype muscarinic recptor에 대한 선택적 활성화를 보여주는 모식도.

 

2.4.1 DREADDs의 작용원리

신경과학에 사용되는 DREADDs는 GPCR의 원리를 적용한 것으로 GPCR은 ligand 의존적으로 또는 독립적으로 ‘완전히 활성화된’, ’일부 활성화된’, ’완전히 불활성화된’, 그리고 ’일부 불활성화된’ 4가지 상태가 존재한다. 4가지 상태는 이종 삼량체(heterotrimeric) G 단백질과 beta-arrestin과 상호작용하기 때문에 가능한데, 최근까지 알려진 바에 의하면 불활성화된 상태는 ligand에 의해 안정화될 수 있고 ligand가 없는 상태에서도 일어날 수 있다고 한다. 이런 불활성화 상태를 안정화할 수 있는 물질은 ‘반 작용제(inverse agonist)’로 작용하는데 이는 본래의 활성에 반하는 길항제(antagonist)로 작용하는 것을 말한다. ‘완전히 활성화된’ GPCR은 작용제가 수용체에 결합한 상태에서 G단백질이 결합하여 하위 단계로 신호를 전달할 수 있는 구조를 말한다. 이 활성화 상태는 ligand가 없어도 (즉, 수용체와 G단백질의) 이량체 상태로 하위 신호를 전달할 수 있는데 이러한 상태를 ‘constitutive activity’라 부른다 [40-43]. GPCR은 G단백질이 아닌 beta-arrestin (βArr)과도 상호작용할 수 있다. βArr 역시 수용체와 constitutive activity 상태를 형성할 수 있으며 이 상태에서는 수용체와 G 단백질의 결합을 구조적으로 방해할 수 있어 G단백질의 신호전달을 감소시키는 효과를 보인다 [44].

‘Constitutive activity’로 인해 DREADDs의 적용은 ligand 없이도 DREADDs의 활성화가 가능할 거란 우려가 제기되었다 [45]. 이러한 점을 극복하기 위해 2세대 화학유전학 기법으로 적용된 GPCR은 합성 ligand (RASSLs)에 존재 하에서만 활성화되도록 제작되었다 [45, 46]. Basal activity가 측정되지 않는 DREADDs 는 basal activity가 완전히 없다는 의미는 아니기 때문에 만일 연구에서 basal activity가 관측되는 경우, 질량 보존의 법칙에 근거하여 수용체의 발현을 줄이면 constitutive activity를 보이는 수용체도 줄어드는 원리를 적용할 수 있으며 수용체의 발현을 줄이는 방법으로 1) DREADDs를 도입하는 바이러스의 titration을 줄이거나 2) 활성이 낮은 프로모터를 사용하거나 3) 유전자 서열 중 WPRE (woodchuck hepatitis virus element)와 같은 전사 발현을 조절하는 부위를 추가/제거와 같은 방법들이 제시된다.

DREADDs 적용 시 발생되는 또 다른 우려는 수용체-작용제와의 결합 이후 수용체의 세포 내 유입과 같은 일련의 생물학적 반응으로 인한 수용체의 down-regulation과 desensitization이 있다. 이 부분은 수용체를 자극할 수 있는 ligand를 반복 투여하거나 용량을 조절하는 방법을 사용하도록 권고된다 [47].

DREDDs는 GPCR을 이용한 수용체이므로 ‘Receptor Reserve’ 현상이 나타날 수 있다. ‘Receptor Reserve’은 저농도의 비가역적 작용제를 투여하였을 때 반응을 일으키고 남은 수용체를 말하며 반응하지 않고 남은 수용체들은 생체의 민감도와 반응을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 즉, DREADDs를 생체 내 존재하는 GPCR보다 상대적으로 과발현시킬 때 세포 및 행동 반응이 반복적으로 유의하게 측정될 수 있게 된다. 즉, 바이러스나 유전자재조합 동물을 이용해 DREADDs를 발현시키면 유의한 desensitization이 발견되지 않는다 [48, 49].

DREADDs 적용 시 생각해봐야 할 부분은, DREADDs의 활성으로 나타나는 세포 반응 또는 행동 반응이 GPCR 일반적인 신호전달 때문인가 아닌가 하는 개념적인 문제이다. 조항제에 의한 수용체 자극은 다양한 하위 신호전달 체계를 통하기 때문에 단순히 증가 또는 감소되었다고 말하기 어려울 수 있다. 특히, 내재적 βArr 신호전달의 활성화에 대한 우려가 제기된다. 하지만 최근까지도 DREADDs에 의한 신경세포 발화의 변화를 다른 기전 때문으로 설명하는 연구 결과는 없다. 이와 일맥상통하게 DREADDs와 광유전학을 병용한 연구에서 두 실험 기법이 동일한 생리학적 효과를 보임을 확인된 바 있다. 더욱이 DREADDs는 광유전학 기법보다 작용 시간이 길기 때문에 행동 변화를 유도하고 해석하기 유리한 장점을 지닌다.

2.4.2 DREADDs의 종류

DREADDs의 개발은 1991년도에 1세대 ‘allele-specific GPCR’, 1998년~1999년도에 2세대 ‘RASSLs과 재조합된 GPCR’, 그리고 2000년대에 들어 3세대인 ‘KORD와 재조합된 GPCR’들이 발표되었다 [50-52] (그림 3).

 

다양한 DREADDs의 종류와 반응하는 ligand
그림 3. 다양한 DREADDs의 종류와 반응하는 ligand.
hM3Dq,GsD,hM4Di,Rq (R165L)은 CNO, perlapine, compound21의 자극에 반응할 수 있으며 각기 다른 G 단백질들과 상호작용할 수 있다. KORD는 salvinorin B의 자극에 반응하여 Gai 단백질과 상호작용할 수 있다.

 

① hM3Dq: 신경세포 활성을 촉진하기 위한 수용체로 Gq 단백질을 이용한 hM3Dq와 ligand로 clozapine-N-oxide (CNO)의 조합이 일반적으로 사용된다. Gq-DREADDs는 낮은 CNO의 농도 (nM)에서 활성화되어 세포 내 칼슘 분비를 증가시켜 신경세포 활성을 촉진한다 [52]. DREADDs 수용체를 활성화시키는 CNO는 0.1~3mg/kg의 농도 범위에서 마우스(mouse)와 렛(rat)에 약리학적, 행동학적 작용을 나타내지 않으며 기니피그와 사람, 그리고 영장류에서 clozapine으로 대사되는 것으로 알려져 있다 [53]. 비록 CNO가 인체에서 대사되어 10% 미만으로 남아있다 하더라도 clozapine의 부작용(예를 들어, 저혈압, 진정, 항콜린성 신드롬)을 유념해야 한다. 이를 위해 수용체 발현 없이 CNO만 투여하거나 수용체 발현하는 동물에 CNO 가 포함되지 않은 용매만 투여하는 등의 적절한 대조군이 필요하다.

CNO는 체내에서 빨리 퍼트려 나가고 분포하는 것으로 알려져 있다. 특히 복강투여 시 60분 동안 체내에 잔존하는 것으로 알려져 있다 [54]. 이러한 ligand의 특성으로 인해 hM4Dq의 작용으로 인한 신경세포 활성의 촉진이 강력하고 길게 유지되는 연구 결과가 보고되었다 [48, 55]. CNO는 적은 농도로도 DREADDs를 효과적으로 활성화시킬 수 있기 때문에 높은 농도의 CNO 적용은 DREADDs 활성화를 오랫동안 유지할 수 있게 한다. 반면, 낮은 농도의 CNO 투여는 상대적으로 DREADDs의 활성화를 빨리 감소시킬 수 있다.

CNO는 설치류가 아닌 동물에서는 대사되어 N-desmethyl-clozapine (NDMC)를 형성할 수 있기 때문에 perlapine, compound 21과 같은 CNO가 아닌 ligand가 발표되었고 이 ligand는 DREADDs가 아닌 다른 muscarinic GPCR과 상호작용을 거의 하지 않으며 비유효성 효과를 적게 갖는 것으로 확인하였다 [53, 56].

② hM4Di, hM4Dnrxn, KORD: 신경세포 활성을 억제하기 위한 수용체로 Gi 단백질을 이용한 hM4Di, 신경세포의 축삭과 축삭 말단에서 작용하는 hM4Di의 변이체인 hM4Dnrxn, 그리고 κ-opioid-derived DREADDs (KORD)가 개발되었다. hM4Di는 CNO, perlapine, compound 21에 의해 활성화되는 반면, KORD와 hM4Dnrxn는 salvinorin B에 의해 활성화된다. Salvinorin B는 350 이상의 GPCR과 반응성이 테스트되었으며 비유효성 효과는 나타나지 않는 것으로 확인되었다 [57, 58]. hM4Di와 KORD는 GIRKs (G-protein inwardly rectifying potassium channels)의 활성화를 Gβ/γ가 매개하여 과분극 시켜 신경세포 활성을 억제하거나 축삭 말단에서 신경전달물질의 방출을 억제하는 두 가지 기전으로 작용한다. 즉, 짧은 시간 동안 강한 과분극을 유도하는 광유전학 기법과는 달리 DREADDs는 수초에서 길게는 몇 시간 동안 보통의 과분극을 유도하여 강한 신호전달물질 방출 억제가 이뤄지는 셈이다 [57].

③ GsD: GsD는 hM3Dq의 세포 안쪽 부분을 turkey erythrocyte β adrenergic receptor로 치환하여 Gs 단백질과 결합하도록 설계된 DREADDs이다. hM4Dq나 hM4Di와 달리 GsD는 Gs 단백질을 닮은 Gαolf 단백질을 활성화시킬 수 있다 [59]. GsD는 세포 내 cAMP 양을 증가시켜 신경세포의 가소성(plasticity)을 증가시키는 기전으로 보상, 운동민감화 등의 연구에 사용되었다 [59, 60].

④ Rq (R165L): Rq (R165L)은 βArr과 결합하는 DREADDs로 아직까지 in vivo에서 적용된 사례는 없으나 βArr 신호전달과 관련 있는 행동들을 연구하는 데 유용할 것으로 생각된다 [61].

2.4.3 DREADDs의 활용

DREADDs는 광유전학 기법에서 옵신을 적용하는 다양한 방법을 그대로 활용할 수 있다. 예를 들어, Cre/Flp/Dre와 같은 재조합 효소를 이용할 수도 있고 tetracycline (tet-on/ tet-off) 프로모터를 활용할 수도 있다. 또한 다양한 바이러스 타입에 DREADDs를 패키징하여 투여함으로써 특정 신경회로만 선택적으로 활성을 촉진 또는 억제할 수 있다. 또한, ligand를 cannula를 이용해 뇌의 국소 부위에 투여한 경우 선택적인 신경세포를 타겟할 수 있다 [62, 63]. hM3Dq- CNO와 KORD-salvinorinB의 조합을 이용하면 DREADDs도 한 동물 내에서 신경세포 활성을 촉진/억제할 수 있다 [57].

Perlapine의 경우, 일본에서 불면증의 치료제로 승인 받았으며 당뇨, 대사질환, 파킨슨병, 염증성 질환 등의 다양한 질병/질환에서 DREADDs의 치료제 적용을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다 [53].

2.5 신경세포 활성 조절을 위한 다양한 접근

2.5.1 광유전학과 화학유전학의 상보적 사용

DREADDs는 새로운 합성물질을 사용하여 GPCR을 자극하여 비교적 오랫동안(몇 시간 이내까지) 자극 상태를 유지할 수 있고 광유전학 기법은 특정 빛에 반응하는 다양한 옵신을 적용할 수 있기 때문에 두 기법은 상보적으로 적용 가능하다. 2014년 Stachniak는 ARC (arcuate nucleus of hypothalamus)에 있는 AgRP (Agouti related peptide)를 발현하는 신경세포에 hM3Di와 ChR2를 동시에 발현시켜 음식 섭취와 관련한 연구를 진행하였다 [63].

2.5.2 신경세포 활성 조절을 위한 다양한 접근법

자기장이 hysteresis를 통해 열이 발생하는데 이때 열에 반응하는 TRPV1 (transient receptor potential cation channel subfamily V member 1)을 과발현시킨 나노입자를 뇌에 도입하면 자기장에 의해 신경세포의 과분극이 유도된다 [64]. 이러한 적용은 조직 내에 나노입자 도입의 어려움과 TRPV1 발현의 잠재적 부작용 등의 한계를 극복해야 한다. 또 다른 그룹에서는 ferritin과 MagR과 같은 자기장에 반응하는 non-channel 철분 결합 단백질을 이용한 single-compound magnetogenetics를 구상하고 있는데 이 아이디어 역시 자기장과 열의 부작용을 고려하는 숙제가 남게 된다. 최근 초음파를 이용한 신경세포 활성 조절(sonogenetics)이 소개되었는데 광유전학 기법보다 느린 반응을 보였으며 발화하는 신경세포의 타겟을 정확히 통제하지 못하는 것으로 생각된다 [65].

3. 맺음말

신경세포 활성을 조절하는 새로운 기법들이 개발되고 적용됨으로써 기억, 감정, 지각, 인지, 행동 조절과 같은 다양한 뇌의 역할에 대한 이해는 날로 깊어지고 있다.

본 동향보고서에서 소개된 기법들을 연구에 적용하고자 하는 분들을 위해 유용한 웹사이트들을 아래와 같이 소개하고자 한다.

① 광단백질의 종류 및 기능 확인:
https://web.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/sequence_info.html#swichrpp

② 광유전학 기법과 DREADDs 연구용 바이러스:
UNC vectorcore: https://gtp.med.upenn.edu/
Addgene: https://www.addgene.org
Duke viral vector core: https://sites.duke.edu/dvvc/collection-aav/
UPENN vector core: https://gtp.med.upenn.edu/core-laboratories-public/vector-core

③ 재조합효소가 도입된 동물 정보:
NIH neuroscience blueprint cre driver network: http://www.credrivermice.org/
Jaxson Lab: https://www.jax.org/research-and-faculty/resources/cre-repository#

④ 마우스의 뇌 해부학자료:
GENSAT project at the Rockefeller University: http://www.gensat.org
Allen brain atlas: http://mouse.brain-map.org/

4. 참고문헌

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허수희(2019). 최근 신경과학 연구에 사용되는 신경세포 활성 조절기법 소개. BRIC View 2019-T15. Available from http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3234 (May 30, 2019)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
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