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유전체 교정 기술 발달에 따른 형질전환동물 생산
유전체 교정 기술 발달에 따른 형질전환동물 생산 저자 임윤기 (University of Rochester)
등록일 2019.05.07
자료번호 BRIC VIEW 2019-T14
조회 762  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
기존의 형질전환동물 생산은 무작위로 돌연변이를 일으켜 원하는 돌연변이를 선별하거나 외부유전자를 바이러스 등을 통해 주입하여 이루어졌다. 따라서 기존의 방식으로는 하나의 형질전환 동물을 생산하기 위해 많은 시간과 노력이 필요했으나 실험자의 의도를 반영하기에는 정확도가 떨어지는 등의 한계가 있었다. 또한 외부 유전자 유입을 통한 형질전환은 발생 초기 효과가 없기 때문에 발생단계에서부터의 변화를 관찰하기 위해서는 유전체 편집이 필요했다. 또한 기존의 방법보다 저렴하고 빠르며 정확한 유전체 교정이 가능해지면서 전에는 불가능했던 연구들에 활로를 열어주고 있다. 이렇게 다양한 이유로 유전체 편집은 여러 분야에서 요구되었으며 최근 다양한 크리스퍼의 발견으로 짧은 기간에 가파른 성장을 이루었으며 앞으로의 확장성은 활짝 열려있다. 우리는 이번 보고서를 통해 발전하는 크리스퍼 시스템을 살펴보고 유전체 교정기술의 발달에 따른 형질전환동물 제작의 전략과 활용 변화를 알아보고자 한다.
키워드: Genome editing, CRISPR, Cas9, Cpf1, transgenic animal, genetic modification
분야: Molecular_Biology, Genomics
목차

1. 서론
2. 본론
  2.1 크리스퍼 시스템
  2.2 유전체 교정 기술을 통한 형질전환동물 생산 방법
  2.3 유전체 교정기술의 발달에 따른 유용한 형질전환 동물
    2.3.1 유전질환과 Gene therapy 모델
    2.3.2 Humanized 모델
    2.3.3 다중 돌연변이 모델
3. 결론
4. 참고문헌


1. 서론

2017년 영국 정부의 보고에 따르면 그 해 190만 건의 형질전환동물의 생산이 있었으며 이 동물들은 기초과학과 신약개발 등에 사용되었다고 한다. 그리고 질병모델로의 활용이 갈수록 증가하는 추세라고 한다 [1]. 어떻게 단기간에 많은 형질전환동물의 생산과 다양한 질병모델제작이 가능했던 것일까? 그것은 아마도 크리스퍼(CRISPR)를 통한 유전체 교정기술의 발달 때문일 것이다. Feng Zhang은 2013년 동물세포에서 크리스퍼를 이용한 유전체 교정을 처음으로 성공하여 Science 지에 발표함과 동시에 모든 기술을 공개하였다. 이로 인해 이 논문은 유전체 교정 분야에서 가장 많이 인용되고 있으며 논문에서 사용한 크리스퍼 클론은 발표 3년 만에 25,000 건 이상 Addgene을 통하여 배포되었다 [2]. 공개된 기술은 분자생물학, 구조생물, 시스템생물학 등 다양한 분야의 연구자들 유입을 가능하게 했고 그 결과 유전체 교정의 정확성과 효율은 계속 좋아지고 있다. 이로 인해 유전체 교정을 통한 질병치료의 가능성을 인정받아 투자가 활발히 이루어져 특허와 startup의 숫자도 증가하고 있다. 2년 전 Feng Zhang의 연구발표에서 앞으로의 계획 중에는 새로운 크리스퍼 단백질을 찾는 것도 있었는데 최근 그는 새로운 크리스퍼인 Cas12b에 대한 연구결과를 논문으로 발표했다. Cas12b는 adeno-associated virus (AAV)를 이용한 전달에 최적화되어있다고 한다 [3]. 그리고 그는 이 기술을 발전시켜 나가기 위해 또 다른 startup 만들어 언론의 주목을 받고 있다 (그림 1).


Feng Zhang이 앞으로의 연구계획을 발표하고 있다
그림 1. Feng Zhang이 앞으로의 연구계획을 발표하고 있다.
그리고 그와 연관된 크리스퍼 관련 회사의 로고들이다.


그렇다면 우리는 이렇게 발달한 유전체 교정 기술을 어떻게 활용하고 있을까? 아마도 이제는 거의 모든 실험실에서 흔하게 사용하고 있는 유전체 교정을 통한 형질전환동물 제작일 것이다. 이제는 유전체 조작 기술을 통해 자신이 연구하는 유전자를 특정하여 삭제하거나 형광단백질 유전자를 삽입하여 표지하는 등의 다양한 조작이 빠르고 정확하게 이루어져 예쁜꼬마선충의 경우 보통 1개월, 마우스의 경우 6개월이면 제작에서 screening까지 끝낼 수 있다. 그리고 기술의 보편화는 유전체 편집기술로 형질전환동물을 대신 만들어주는 회사까지 만들었다. 이 보고서에서는 크리스퍼로 달라진 형질전환동물 제작방법과 그에 따른 실험전략 변화를 알아보고 유용한 형질전환동물을 소개하려 한다.

2. 본론

2.1 크리스퍼 시스템

2003년 Mojica가 E. coli에서 P1 phage의 DNA sequence의 발견으로부터 크리스퍼 시스템은 미생물이 바이러스로부터 자신을 보호하기 위해 사용하는 적응면역(adaptive immune) 시스템임이 밝혀졌다 [4]. 이후 여러 과학자들의 노력으로 다양한 크리스퍼가 발견되었다 (표 1).

표 1. 크리스퍼 시스템.
크리스퍼 시스템
CRISPR 시스템은 class 1 (multi-subunit effectors)과 class 2 (single protein effectors)로 분류되며 이는 다시 5 종으로 세분화된다. 현재 Class 2만이 유전체 교정에 사용되고 있다. 다만 Class 1의 Type III-B는 DNA보다는 RNA를 표적으로 삼는 것으로 알려져 있다 [2].


여러 미생물로부터 다양한 크리스퍼를 발굴하는 연구는 유전체 교정을 통한 형질전환 동물 생산의 정확성과 효율을 증가시키는 데 중요하다. 그 예로 현재 가장 많이 사용하는 Cas9만을 사용하여 형질전환동물을 만들다 보면 타깃 시퀀스 선택에서 PAM 시퀀스 때문에 한계를 느끼게 된다. 좀 더 다양한 PAM 시퀀스와 더 단순한 형태를 원할 때가 있다. Cpf1은 tracrRNA가 필요 없고 Cas9과는 다른 PAM 시퀀스를 가져 타깃 시퀀스의 선택 폭이 넓어진다. 그리고 Cas12b은 AAV에 의한 전달이 우수하다 [3].

2.2 유전체 교정 기술을 통한 형질전환동물 생산 방법

초기 크리스퍼를 통한 유전체 교정은 녹아웃 모델을 만들기 위해 주로 사용되었는데 그 방법으로 치환을 위한 homology-directed repair (HDR) template 없이 single guide RNA (sgRNA) 또는 CRISPR RNAs (crRNAs)를 통한 돌연변이를 유도하여 타깃서열 주변에 1~6개의 짧은 염기의 삽입이나 삭제된 돌연변이를 보통 PCR을 통해 1차 선별하고 다시 염기서열 분석을 통해 프레임 전환으로 stop codon이 만들어진 난센스 돌연변이(nonsense mutation)를 최종 선정한다 (그림 2A). 현재 이 방법은 원하는 돌연변이를 선별하는 작업이 오래 걸려 단순 돌연변이를 제작하기 위해 사용하기보다 무작위로 돌연변이를 일으켜 특정 조건에서 표현형의 변화를 보이는 돌연변이를 찾는 screening 용도로 사용된다. 치환은 특정 염기서열을 삽입, 삭제 또는 치환이 가능한 방법으로 질병과 연관된 SNPs를 기반으로 연구를 시작하는 그룹에서 많이 사용한다 (그림 2B). 삽입은 형광단백질 등의 tagging을 위해 주로 사용된다. 타깃 유전자의 발현을 extrachromosomal array처럼 과발현이 아닌 endogenous한 레벨에서 관찰이 가능하고 germline에서의 발현도 관찰이 가능하다는 장점이 있다 (그림 2C) [5, 6]. 이후 실험동물의 종류와 실험 목적에 따라 CRISPR delivery systems을 결정하게 된다. 그 방법으로는 microinjection, electroporation, AAV, lentivirus, adenovirus, lipid nanoparticles/liposomes, gold nanoparticles 등으로 다양한 기법들이 사용되며 또 개발되고 있다. 형질전환동물 생산에 가장 많이 사용하는 것은 microinjection으로 예쁜꼬마선충의 경우에는 생식선에 직접 microinjection 하지만 마우스와 같은 포유류의 경우에는 embryonic stem cells (ESCs)에 microinjection한 후 blastocyst에 injection한다. 반면 인간의 질병 치료 목적으로 가장 주목받고 있는 것은 AAV로 조직 특이적 delivery라는 장점을 가져 발병 조직 특이적 유전체 편집이 가능하다 [6].


크리스퍼를 이용한 다양한 유전자 편집 방법
그림 2. 크리스퍼를 이용한 다양한 유전자 편집 방법.


2.3 유전체 교정기술의 발달에 따른 유용한 형질전환 동물

2.3.1 유전질환과 Gene therapy 모델

현재 시퀀싱 기술과 생물정보학의 발달로 환자나 돌연변이의 다양한 대용량 데이터들이 데이터베이스화되어있어 타깃 유전자의 발굴 과정이 정교해지고 있다. 또한 여기에 유전체 편집 기술까지 더해져 실험 모델동물을 제작하는 단계에서 비용과 시간적인 면에서 단축되어 예전에는 상상할 수 없는 다양한 실험 전략이 가능해졌다. 예를 들어 환자와 대조군의 Genome Wide Association Studies (GWASs) 결과를 통해 얻은 Single-nucleotide polymorphisms (SNPs)를 바탕으로 질병과 관련된 SNPs을 발굴하고 타깃 유전자를 선정하는 것이 보통의 과정이다. SNPs가 코딩 부위에 있다면 쉽게 타깃 유전자를 특정하고 domain 정보를 바탕으로 SNPs가 stop codon을 만드는지 아니면 post-translational modification (PTM) 부위에 위치하여 단백질의 기능에 영향을 주는지 등의 예측이 가능하다. 하지만 대규모 GWASs 결과에 따르면 대부분의 SNPs는 non-coding 서열에 존재하고 non-coding SNPs 연구에는 quantitative trait locus (QTLs)와 같은 다양한 정보가 요구된다 [7, 8]. 위의 과정을 통해 타깃 SNPs가 선정되면 여기서부터 크리스퍼를 통한 유전체 편집기술이 빛을 발하기 시작한다. 예를 들어 특정 질병의 환자에서 SNPs가 G/A가 발견되었다면 유전체 편집을 통해 G/A, G/G, A/A 이렇게 3개의 형질전환동물을 만들어 비교해가며 기능연구를 할 수 있다 (그림 3). 예전에는 loxP-Cre system을 이용한 타깃 유전자의 과발현 또는 억제하는 형질전환 모델이 주로 사용된 반면 크리스퍼는 그보다 적은 비용과 시간으로도 정확하게 염기서열 하나까지도 교정이 가능하기 때문에 위와 같은 실험 전략이 가능한 것이다. 그리고 크리스퍼를 이용해서 원하는 유전체 편집 형질 전환동물을 만들어주는 업체들이 생겨 유전체 교정기술과 장비 없이도 연구가 가능하다. 이처럼 유전체 교정 기술 발달은 형질전환 동물 디자인 과정뿐만 아니라 전체적인 실험 전략에까지 영향을 주고 있으며 자신의 연구에 가장 유용한 형질전환동물을 제공해 주고 있다.


SNPs으로부터 유전체 교정 형질전환동물 생산에 이르는 flow chart
그림 3. SNPs으로부터 유전체 교정 형질전환동물 생산에 이르는 flow chart.


2.3.2 Humanized 모델

환자 유래 세포를 가지고 실험할 수 있지만 세포 수준의 연구라는 한계로 인해 동물 모델 같이 하나의 개체 수준의 연구가 필요하다. 하지만 사람을 실험에 이용할 수 없으므로 humanized 모델을 만들어 사용한다. 가장 기본적인 humanized 모델은 크리스퍼를 이용하여 모델동물의 타깃 상동유전자를 잘라내고 그 자리를 인간의 유전자로 치환하는 것이다. 인간의 유전자를 발현하는 형질전환동물로 좀 더 인간과 가까운 연구 효과를 얻을 수 있다. 또한 환자의 유전자를 발현하는 형질전환 동물과 비교하며 실험을 진행하기도 한다.

Patient-derived xenograft (PDX) models은 혈액암(hematologic malignancies)에 대한 신약 전임상 시험에 많이 사용되고 있다. Xenograft란 이종 간의 장기, 조직, 세포 등을 이식을 칭하는 단어로 여기서 “xeno”는 외부라는 뜻한다. 면역이 억제된 마우스에 환자의 암세포나 조직을 이식해서 만든다. 하지만 primary cancer cells 또는 tissues를 만들 수 없는 한계가 있어 보다 강력한 면역 결핍이 요구되어 CD34+ human hematopoietic stem cells (HSCs)을 이식한 PDX가 만들어졌지만 크리스퍼의 발달은 인간의 면역 체계를 가진 마우스 생산을 기대하게 한다. 더 나아가 personalizing humanized mice까지 생각해 본다 [9].

2.3.3 다중 돌연변이 모델

암 연구에서 단일 유전자 변이에 의한 연구가 지금까지는 주를 이루고 있었지만 한 번에 여러 유전자에 돌연변이를 일으킬 수 있는 유전체 편집 기술의 발달로 여러 유전자의 조합에 의한 암 연구가 가능해졌다. 그 예로 3개의 유전자(Trp53, Brca2, Pten)의 돌연변이를 만들어 각각의 단일 돌연변이에서는 볼 수 없었던 변화를 관찰할 수 있었다 [10]. 또한 multiple epigenetic changes 연구에도 유용할 것이다.

3. 결론

유전체 편집 기술은 생물학에서 혁명적인 기술혁신이다. 원하는 돌연변이를 얻기 위해 독한 화학약품과 방사능을 처리하고 복권 당첨을 기다리는 마음으로 screening 했던 연구자들의 수고를 덜어주었을 뿐만 아니라 모든 노력에도 불구하고 돌연변이를 얻지 못해 연구를 축소 또는 포기해야 했던 일이 사라졌다. 더 나아가 유전체 편집의 높은 정확성과 다양한 응용 기술은 연구자들의 상상력을 자극하며 새로운 연구전략을 만들었고 의미 있는 결과들을 얻고 있다. 이제는 질병 모델 동물이 중요 유전자의 돌연변이나 발병 유전자의 과발현에서 좀 더 세분화되고 개인화되어 가고 있는 동시에 광범위한 유전자 변이들의 조합으로 생명현상 본연의 종합성과 복잡성을 반영해 가고 있다. 이것은 인위적인 조작으로 만들어진 극단적 연구에서 조금은 더 자연스러운 생명현상에 근접해가는 것이라 생각된다. 그런 의미에서 크리스퍼는 가장 유용한 형질전환 동물을 각각의 연구자에게 실현시켜 주고 있다고 생각한다. 하지만 화려한 기술 이면에는 그늘도 있다. 작년 Jiankui는 홍콩대에서 열린 학회에서 “CCR5 gene editing in mouse, monkey and human embryos using CRISPR/Cas9” 라는 제목으로 자신의 연구결과를 발표했는데, HIV 감염에 중요한 chemokine receptor 5 (CCR5)를 여러 동물모델과 인간 줄기세포에서 유전자 교정 기술을 이용하여 교정한 결과였다. 하지만 이 발표가 논란을 일으킨 이유는 발표 막바지에 CCR5 유전자가 교정된 채 태어난 쌍둥이 자매에 대한 연구내용 때문이었다 [11]. 이 글에서 연구 윤리에 대한 이야기를 하려는 것은 아니다. 다만 우리는 유전체 교정 아기가 가능할 만큼 유전체 교정 기술이 발달한 시대에 살고 있다는 것이다. 그리고 실험실 밖 사람들 중에는 실험실에서 영화에서 나올법한 괴물이 만들어질 거란 걱정을 하기도 한다. 제2의 Jiankui가 나오는 것을 막기 위해 세계는 유전체 편집 기술의 가이드라인을 만들기 시작했다. 부디 합리적인 가이드라인이 만들어져 인류 모두에게 유익한 유전체 교정 기술의 혜택이 돌아가길 바래본다.

4. 참고문헌

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임윤기(2019). 유전체 교정 기술 발달에 따른 형질전환동물 생산. BRIC View 2019-T14. Available from http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3218 (May 07, 2019)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
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