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Innate lmphoid cell group2의 연구동향과 실험방법론
Innate lmphoid cell group2의 연구동향과 실험방법론 저자 표경호 (연세대학교 의생명과학부 / 유한-연세 폐암 중개연구소)
등록일 2019.04.18
자료번호 BRIC VIEW 2019-T12
조회 551  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
Innate lymphoid cell (ILCs)는 표현형을 구분할 수 있는 CD마커의 지속적인 발견, 그리고 Flow cytometry 기술발전과 함께 subset들의 기능적 세분화가 이루어져 왔으며 현재 다양한 질병의 연관성이 밝혀지고 있는 면역세포이다. ILC는 염증의 시작단계부터 획득면역조절에 이르기까지, 그 역할의 중요성이 주목받고 있다. 특히 ILC2와 다양한 염증성 질환과의 연계성이 보고되면서, ILC2를 이용한 연구를 진행하고자 하는 연구자들이 늘어나고 있어 ILC2 연구의 방법론적인 부분에 대한 관심도가 높아졌다. 이번 리뷰에서는 ILC2에 대한 연구 동향과 함께 실험에 대한 방법론적인 부분 등을 소개함으로써, ILC2에 대한 연구를 진행하고자 하는 연구자들에게 도움이 되었으면 한다.
키워드: Innate lymphoid cell 2, 실험 방법, 분석 방법
분야: Molecular_Biology, Cell_Biology
목차

1. 서론
  1.1 Innate lymphoid cell (ILC)의 종류와 분화
  1.2 ILC2 연구의 필요성
  1.3 ILC2 연구동향 (Web of Science를 통해 분석)
2. 본론
  2.1 Lineage negative 항체와 리스트
  2.2 ILC2 identification(표면인자)와 발현되는 사이토카인
  2.3 ILC2 induction 방법 (in vivo)
  2.4 조직에서의 ILC2 분리방법
  2.5 Flow cytometry를 활용한 ILC2 분석방법
  2.6 Single cell RNA seq을 활용한 ILC2 연구방법
3. 결론
4. 참고문헌


1. 서론

1.1 Innate lymphoid cell (ILC)의 종류와 분화

초기연구에서 Human ILC로 인식된 Natural killer (NK) 세포나 lymphoid tissue inducer (LTi) 세포들 이외에도 추가적으로 다양한 형태의 ILC family 들이 세포의 CD마커와 더불어 전사인자(Transcription factor, TF)와 사이토카인의 발현에 따라 구분되었고, 이들 세포에 대한 기능들이 감염이나 질병과 연관되어 연구되고 있다 [1, 2]. 이번에 리뷰하는 Innate lymphoid cell (ILC)는 3가지 group 가운데, ILC2에 대한 부분을 다룰 예정이며, 간단히 ILC의 group에 따라 그 특징을 요약하여 보았다.

Group 1 ILC는 IL-12와 IL-18자극에 의하여 T-bet과 IFN-gamma를 생산할 수 있는 ILC로 [3], 감염이나 상처에 의하여 유도된 pathogen associated molecular pattern (PAMP)으로부터 자극되고 주변조직에서 발견된다 [4]. ILC1은 IFN-gamma, perforin과 Eomesodermin (Eomes)를 발현하며 감염된 세포나 비정상적인 암세포 등에 대한 살세포기능을 가지고 있다. ILC1과는 달리 Group 2 ILC는 GATA3의 발현과 더불어 IL-13, IL-15의 발현이 증가하며, IL-25, IL-33과 같은 사이토카인에 의하여 자극을 받는다 [5]. 뿐만 아니라, Thymic stromal lymphopoietin (TSLP)에 대한 자극으로도 동일한 반응이 일어나는데 [6], 알러지에 의한 염증 반응이나 [7], 기생충의 감염에 의한 반응 등으로 ILC2 면역반응이 유도된다 [8]. 사람의 경우 ILC2는 말초혈액, 폐, 피부 그리고 지방 세포 등에 서 발견이 되며, 태아의 장 등에서 확인된다 [9]. 그리고 Group 3에 해당하는 ILC3는 RORγT의 발현과 더불어 IL-17, IL-22가 생성되며, 이를 자극하는 사이토카인으로는 IL-1β와 IL-23가 존재한다. ILC3는 태아의 LTi 세포와 이후에 출산 이후 성장하면서 생성되는 ILC3를 포함한다. 마우스의 ILC는 초기에 fetal liver (FL)에서 발달을 하다가, 이후 성체가 되었을 때 골수에서 발달한다 [10]. 골수에서 발달된 CLP는 Lin-Thy1-Sca1loc-KitloFlt3+IL-7Ra+의 표현형을 가진다. 분화 초기의 마우스 ILC 계열의 세포는 Tcf-1을 필요로 하는데, Tcf-1은 Id2, NFIL3의 억제자로 작용을 하고 CLP에서 ILC로의 분화를 위해서는 TOX가 필요로 한다 [10]. 마우스의 실험을 통해 CLP에서 CILP로, 그리고 CHILP를 통해 ILC1, 2 그리고 ILC3로의 분화한다는 것이 확인되었다. 앞서 마우스 연구를 토대로 하여 연구가 되었던 ILC의 분화와 비교하여 human에서의 ILC의 분화에 대한 부분을 정리하여 보면 다음과 같다. ILC1는 CHILP를 통해 분화를 하지만, NK세포는 CILP을 통해 분화되는 것으로 보고 있다. 좀더 최근 연구에 의하면, 미성숙 ILC1이나 ILC1의 전구 세포인 ILC1p가 NK세포의 초기 발달과정 단계와 겹치는 형태의 표현형을 보이고 있고 이를 토대로 추가적인 연구가 추후 더 진행되어야 할 것으로 보인다. 이러한 의미에서 세포의 분화와 기능을 연구하는데 있어 다양한 표현형 연구가 필요할 것으로 보인다.


ILC2의 분화와 표면인자 그리고 사이토카인
그림 1. ILC2의 분화와 표면인자 그리고 사이토카인


1.2 ILC2 연구의 필요성

ILC2은 기생충의 감염에 대한 반응으로 감염 부위에서 발견된다. ILC2를 활성화시킬 수 있는 사이토카인으로 IL-25, IL-33이 있으며, 이는 기생충 감염에 의하여 자극을 받았을 때 활발하게 증가됨을 확인하였다. ILC2는 Th2 면역 세포와 함께 감염 억제에 대한 효과가 증가된다 [11]. 감염에 대한 반응으로 상피세포에서 발현되는 IL-25, IL-33, TSLP는 ILC2의 증가를 가져오고, ILC2는 자극에 대한 반응으로서, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13을 발현하여 호산성구증(Eosinophillia)을 유발함과 동시에 수지상세포(Dendritic cell, DC)로부터 Th2 세포로 분화, 증식된 세포와 함께 병원체의 억제효과를 보인다. 이를 증명하기 위해서 T세포가 결여되어 있는 RAD-deficient 마우스에서 호산성구와 상피세포 과증식, 그리고 점액 생성이 감소되는 것이 확인되었다 [12]. ILC2는 항원특이적인 Th9 세포의 기능과도 연관이 있다. 선모충 가운데 한가지인 Trichinella spiralis의 실험을 통해 Lin negative이면서 IL-25 receptor가 강하게 발현되는 ILC2를 동물실험을 통해 확인하였고 항원에 특이적인 Th2와 Th9에 의하여 ILC2가 활성화됨을 IL-4, 9, 13의 발현으로 확인했다 [13]. 기본적으로 면역세포는 병원체로부터의 방어를 목적으로 ILC2가 방어기전의 일부로서 반응하는 연구와 더불어, ILC2가 병리학적으로 어떠한 의미가 있는지에 대한 연구들이 진행되어 왔다. ILC2는 Th2 세포와 마찬가지로 IL-4, IL-13과 같은 타입 2 사이토카인이 증가됨에 따라서 천식의 발달에 영향을 주며, 이 밖에도 타입 2 사이토카인 관련 질병과 연관이 있을 것으로 보고 연구들이 진행되고 있다. 이에 최근 ILC와 연관된 연구동향을 확인하여 보았다.

1.3 ILC2 연구동향 (Web of Science를 통해 분석)

ILC2 keyword로 Web of Science를 통해 연구동향을 확인하여 보았다. 2019년 3월 기준으로 동향을 확인한 결과, ILC2와 알러지, 호흡기, 임상, 혈액학과 종양학과 연관한 연구가 대다수를 차지하였다. ILC2를 통해 2019년 현재까지 나온 논문 편수는 총 541편, 항목당 평균 인용수는 29.05, 인용 총합계는 15,718번(자가인용 제외 11,849)로써, 현재까지 ILC2를 토대로 하여 인용된 논문 수는 총 5,572편이다 (Web of Science). 이는 현재까지 ILC2에 관련된 논문이 2012년도를 기점으로 기하급수적으로 증가하고 있다. 현재 ILC2에 직접적으로 작성된 인용도가 가장 높은 논문으로 Hoyler Thomas가 2012년도에 immunity에 작성한 ‘The Transcription Factor GATA3 Controls Cell Fate and Maintenance of Type 2 Innate Lymphoid Cells’ 가 총 371편이 인용된 논문이다 [14]. 그다음으로는 2014년도의 ‘Group 2 Innate Lymphoid Cells Are Critical for the Initiation of Adaptive T Helper 2 Cell-Mediated Allergic Lung Inflammation’이 370편 인용도를 가진 논문이다 [15]. ILC2에 대하여 가장 많은 연구를 진행한 연구기관은 8.6%를 차지하는 UNIVERSITY OF CALIFORNIA SYSTEM (47편), MRC Laboratory molecular biology (35편) 등 상위 10위에 대부분 미국의 연구기관이 포함되어 있다. 그 이후에 영국, 중국, 일본의 순위이며, 한국은 10위에 포함되지 않았다. 미국 NIH의 MeSH (medical subheading)에 ILC를 포함하여 innate lymphoid 등의 term이 아직 포함되지 않아 세부적인 동향 분석이 어려웠다는 점이 아쉽다. 이는 ILC2가 최신 연구임을 반증하는 결과이면서 동시에 ILC2 연구의 증가 추이에 맞추어 Keyword가 확보될 가능성이 높다. 이러한 연구동향에 맞추어 ILC2 연구의 방법론적인 부분에 초점이 맞추어지고 있다. 본문에서는 ILC2연구를 위한 방법론적인 부분을 소개하고자 한다.


 Web of Science를 활용한 ILC2에 대한 연구동향
그림 2. Web of Science를 활용한 ILC2에 대한 연구동향


2. 본론

2.1 Lineage negative 항체와 리스트

ILC2를 구분하는 주된 방법으로는 세포의 표면에서 발현하는 CD마커분석이다. CD마커 가운데에서 ILC2에서 발현하지 않는 lineage 마커들이 존재한다. 이들 lineage 마커들은 T림프구, B림프구, 수지상세포, 대식세포 등을 표적하고 있다. Lineage negative 마커들을 통해 ILC 등을 확인할 수 있다. 초기 ILC2 연구에서 lineage 마커는 연구자에 따라서 항체의 종류와 clone에 대하여 일부 차이가 있다. 최근 lineage cell detection cocktail kit와 같이 lineage 마커에 대하여 고민할 필요 없이 실험을 할 수 있도록 관련 상품이 판매되고 있고, 회사별로 사용하는 항체의 mix와 클론 정보를 제공한다. 대부분의 lineage negative 항체는 T cell, B cell, DC, Macrophage, granulocyte 등을 타겟 하는 항체들로 구성이 되어 있으며, 논문을 비롯하여 최근 판매하고 있는 lineage cocktail에 대하여 아래의 표에 정리를 하였다.

표 1. 상용화된 mouse lineage cell detection cocktail kit와 구성
상용화된 mouse lineage cell detection cocktail kit와 구성

표 2. 상용화된 human lineage cell detection cocktail kit와 구성
상용화된 human lineage cell detection cocktail kit와 구성


각 회사에서 제공하는 Lineage cell detection cocktail의 구성에 차이가 있고, 타겟하는 면역세포의 종류들도 차이가 있다.

2.2 ILC2 identification(표면인자)와 발현되는 사이토카인

ILC2에서 발현하는 표면 인자의 특징은 다른 ILC에 비하여 CD56 negative의 표현형을 가지고 CRTH2 positive가 특징이며, bone marrow에서 기인한 ILC2의 대표적인 마커인 ST2의 발현도 특징으로 보여진다. ILC2가 발견되는 체내 기관은 다양하다. Lung, gut, skin, lymph node, bone marrow와 adipose tissue가 대표적이며, ILC2를 확인하는데 대표적으로 확인하는 marker는 Lin-, CD25, CD69, CD90 (Thy1), CD127, T1/ST2 (IL33R), ICOS, KLRG1, Sca-1, IL-17BR (IL-25R), CD117 (c-Kit)가 있다. ILC2 또한 면역반응을 조절하는 세포로서, 앞서 언급된 표면 인자들은 조직의 손상을 인식하거나, 조직의 산도, 대사체, 등 기계적인 스트레스, 병원체의 PAMP, 온도 등 다양한 부분들을 인식할 수 있는 수용체들이 존재한다. ILC2는 마치 Th2 type 면역세포와 기능적으로 유사하지만, TCR이 없는 상태로 주변 면역세포에 사이토카인과 표면 인자를 토대로 하여 조직으로 침입한 기생충, 바이러스, 알러지 유발원에 대한 자극을 유도한다. ILC2에서 발현하는 사이토카인으로서는 IL-5, IL-13가 있어 B 세포의 체액성 면역반응을 자극, Eosinophil의 항 기생충 반응을 향상, goblet cell에 자극하여 mucosal immune responses를 유도하여 gut에 기계적으로 침입을 억제하는 등의 반응을 유도한다. 이 밖에도 ILC2에서 높게 발현하는 PD-1, ICOS, KLRG1 또한 Th2, Treg, 상피세포 등에 영향을 준다. 앞서 설명한 마커와 사이토카인들을 통해 ILC2를 구분 가능하고, 기능을 확인하기 위하여 사이토카인에 대한 발현을 통해서 ILC2에 대한 활성을 분석한다.


ILC 구분을 위한 표면인자와 사이토카인 발현
그림 3. ILC 구분을 위한 표면인자와 사이토카인 발현


ILC2도 NH cell, Nuocyte, Ih2 cell로 구분이 되고 최근에 알려진 nILC2, iILC2 세포 들에 대한 표면인자들이 보고되면서, 이들을 구분할 수 있는 마커들이 보고되고 있다. 기본적으로 모든 ILC2들은 IL-7Rα를 발현하고 있으나, c-Kit의 경우 Nuocyte, Ih2 세포에서는 발현 차이가 조직 등에 따라서 차이를 보인다. Thy1은 iILC2의 경우 낮게 발현되며, IL-33과 IL-25에 의한 반응 정도도 다르다. 각각의 마커들과 조직의 위치 그리고 반응 정도에 대한 부분을 표로 정리하였다 [16].

표 3. ILC2의 종류에 따른 표면인자와 사이토카인에 대한 반응 여부
ILC2의 종류에 따른 표면인자와 사이토카인에 대한 반응 여부


2.3 ILC2 induction 방법 (in vivo)

ILC2를 자극하고 분화하는데 대표적으로 사용되는 stimuli는 IL-2, IL-7, IL-25, IL-33, TSLP, NmU가 있다. 동물모델에서 ILC2를 증가시키는 방법이 있는데, 대표적으로 house dust mite, papain, Alternaria와 murine 기생충인 Nippostrongylus brasiliensis를 사용하여 자극하는 방법이 있다. 이러한 방법으로 자극을 하면, type 2 면역반응이 증가되면서 lung에서 ILC2가 강하게 증가되는 경향을 볼 수 있다. House dust mite(집진드기)는 천식을 유발하는 주요 인자로서, 동물모델에서 이를 많이 활용하고 있다. 기생충을 이용한 ILC2 유발 방법도 있는데, 이는 기본적으로 Th2 면역반응을 강화시킴으로 인하여 ILC2가 증가되는 방법이다. Nippostrongylus라는 선충을 감염시키는데, 이 기생충은 설치류에 감염되는 기생충으로 분변에서 확보된 충란을 L3 larvae로 성장시킨 뒤 감염을 시키는 방법으로, 감염된 실험동물의 lung 등에서 ILC2가 상당히 높게 증가된다. 이 밖에 곰팡이류인 Alternaria 등을 감염시키는 등의 방법을 사용한다.

2.4 조직에서의 ILC2 분리방법

ILC2를 확보할 수 있는 주요 기관으로서는 lung에서 BALF를 확보하는 방법이나, small intestine, mesentery, 그리고 지방 조직 사이에 존재하는 ILC2도 확보할 수 있다. 각 실험실에서 어떠한 질병 모델을 사용하는지에 따라서 ILC2의 분리 방법이 이미 확보되어 있겠지만, Nature protocol 중 한 논문에 ILC2를 분리하는 방법이 상세히 기술되어 있다 [17]. BALF를 확보하는 방법은 카테터를 사용하는 방법으로 안락사가 일어난 마우스의 흉강을 절제하고 기도를 일부 절제한 뒤, 카테터를 삽관한다. 삽관된 카테터를 이용하여 PBS나 HBSS 혹은 RPMI가 들어가 있는 media를 이용하여 여러 번 BAL용액을 얻어낸다. 이 밖에 다양한 방법 등이 논문에 기술되어 있다.


ILC2 분리방법
그림 4. ILC2 분리방법


2.5 Flow cytometry를 활용한 ILC2 분석방법

장기에서 확보한 single cell 수준의 세포들은 Flow cytometry를 통해 ILC2의 population과 기능을 분석할 수 있다. 각 장기에서 확보한 세포에서 lymphocyte gate, 그리고 live and death를 확인하기 위하여 PI염색을 같이 진행한다. PI negative세포(살아있는 세포)안에서 lineage negative 세포를 확보하기 위하여 lineage cell detection cocktail을 활용하여 negative gate에서 분석을 진행한다. ILC2는 면역 세포이므로 CD45는 positive임과 동시에 ILC2의 특징으로 KLRG1, Sca-1가 동시에 발현하는 gate로 ILC2를 확인하고 분석한다 [17]. Mature ILC2는 KLRG1이 발현된다고 보고가 되어 있다. Sca-1도 KLRG1처럼 ILC2에서 발현되는 표면 인자로 보고가 되어 있다. 이후 Thy1.2, c-Kit, CD25, T1/ST2의 발현은 ILC2안에서도 차이가 있으므로, 각각의 발현은 질병 유발의 정도, 사이토카인의 induction, 감염 등에 의하여 어떠한 변화가 일어나는지를 ILC2의 population과 함께 분석을 한다.


Flow cytometry 분석방법
그림 5. Flow cytometry 분석방법


2.6 Single cell RNA seq을 활용한 ILC2 연구방법

최근 연구의 트렌드로 자리매김한 single cell RNA seq (scRNA seq) 방법은 면역세포에 대한 연구의 방향을 바꾸고 있다고 해도 과언이 아니다. 기본적으로 ILC2가 Th2 세포와 다른 것이 몇몇의 표면 인자의 종류와 전사 인자의 발현 여부를 토대로 하여 분석하였다면, scRNA를 이용한 연구를 통해 면역세포를 좀 더 면밀히 세분화하고, 기능적인 부분에 대한 novel finding을 확보할 수 있는 강력한 tool이다. 기존의 방법 중 microarray나 bulk RNA seq의 경우, 서로 다른 세포의 표현형이 섞여 있어 dilution 되어 있는 형태의 전사체 분석은 분석을 진행하기에도 모호하다. 최근 scRNA seq 기술이 보편화 되면서, ILC 또한 single cell RNA seq 분석을 통해 새롭게 정의되고 있다. IL-25와 IL-33을 통해 자극을 받은 동물의 lung에서 ILC2가 증가하는 것을 확인하고 scRNA을 수행한 결과, IL-33에 의하여 ILC2의 수가 더 강력하게 증가됨과 동시에 GATA3의 발현과 IL-13의 발현이 ILC2에 의하여 공통적으로 증가한다는 것을 확인하였다. 흥미롭게도 scRNA seq 데이터에서 확인된 결과로는 Th2 세포와는 달리, Nmu1 발현이 높음을 확인하였고, 이를 토대로 하여 flow cytometry에서도 동일한 결과를 확인하였다 [18]. scRNA에서 주로 사용하는 chromium 10x 기준으로 10,000개의 세포를 읽을 수 있다고 가정할 경우 조직 내 약 5%가 ILC2라면 500개 정도의 ILC2에 대한 transcriptome을 확인할 수 있다. 좀 더 높은 ILC2를 확보하고 싶다면, flow cytometry sorting이나 magnetic sorting 기술 등을 활용하는 것도 방법이다. 이 밖에도 scRNA seq에 ILC에 대한 다양한 접근들이 있다. PD-1이 높은 ILC progenitor의 기능에 대한 연구 [19], 각 장기 별로 위치하는 ILC2간의 전사체에 대한 landscape 등을 보고하는 등 다양한 연구들이 진행되어 연구되고 있다 [20].

3. 결론

본 동향을 작성하면서, ILC2에 대한 최신 연구의 동향과, ILC2에 대한 연구방법론적인 부분으로 다양한 논문과 실험방법적인 부분들을 확인할 수 있었다. 기존의 연구들이 ILC2의 종류와 기능에 대한 부분에 초점이 맞추어져 왔다면, 이제는 ILC2와 주변의 다양한 면역세포와의 네트워크에 대한 연구들, 그리고 실험방법적인 측면에서 scRNA seq로부터 확보될 좀 더 복잡성이 높은 결과물들을 통해 새로운 ILC2의 연구들이 소개될 것으로 생각된다. 본 동향을 통하여 처음 ILC2에 대한 연구를 진행하는 연구자들에게 도움이 되는 정보가 되었으면 한다.

4. 참고문헌

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표경호(2019). Innate lmphoid cell group2의 연구동향과 실험방법론. BRIC View 2019-T12. Available from http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3212 (Apr 18, 2019)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
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