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실험으로 입증할 수 있는 기능을 토대로 한 long non-coding RNA의 분류법
실험으로 입증할 수 있는 기능을 토대로 한 long non-coding RNA의 분류법 저자 이준규 (한국과학기술연구원 (KIST))
등록일 2019.04.04
자료번호 BRIC VIEW 2019-R08
조회 837  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
지난 10년간, 많은 종들의 게놈이 지속적으로 전사되어 대량의 long noncoding RNAs (lncRNAs) 를 만들어낸다는 것이 알려졌다. 동시에, enhancer나 promoter와 같은 DNA조절 요소들이 양방향으로 전사를 시작할 수 있단 사실 또한 밝혔다. 따라서 거대한 양의 전사체들 중 실제로 기능이 있는 noncoding 전사체들을 구분해 내는 것이 lncRNA 연구분야에서는 시급하자 가장 중요한 문제로 떠오르고 있다. 이 논문에서 저자들은 lncRNA의 기능을 체계적으로 밝히고 분류하는 개념적인 실험 프레임 워크를 제공하고자 한다. 먼저 lncRNA들을 주변 유전자의 발현 조절기능에 따라 cistrans로 구분하고, 정확한 기능과 메커니즘을 밝힐 수 있도록 구체적인 실험 방법들을 제안할 것이다. 이 프레임 워크를 토대로 lncRNA를 더 연구해 나가면 우리가 아는 생체학과 질병에 대한 지식의 한계를 넓힐 수 있는 예상치 못한 새로운 생물학적인 지식을 알려줄 것이라 생각한다.
키워드: Long Noncoding RNAs, cis regulation, trans regulation, experimental framework
분야: Molecular_Biology
본 자료는 Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell, 172 (3), pp. 393-407.의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목차

1. 서론
2. 주변 유전자의 전사를 조절하는데 있어서 lncRNAs의 역할
  2.1. lncRNA의 서열에 따른 주변 유전자의 cis 조절방법
  2.2. lncRNAs의 전사 또는 접합(splicing) 으로 일어나는 cis 조절방법
  2.3. lncRNA Loci 내에 존재하는 기능적인 유전자 조절 요소들
3. trans로 역할을 발휘하는 lncRNA들의 기능
  3.1. lncRNA들이 주변 유전자의 전사와 발현을 trans로 조절하는 방법
  3.2. lncRNA들에 의한 세포핵 구조의 편성
  3.3. lncRNA에 의한 단백질과 RNA들의 상호작용 조절
4. lncRNA유전자 위치의 실험적인 해부
  4.1. lncRNA 유전자 위치의 식별과 정의
  4.2. cis로 작용하는 lncRNA의 기능을 조사하기
  4.3. trans로 작용하는 lncRNA의 기능을 조사하기
5. 결론


1. 서론

인간 게놈의 non-protein coding의 많은 부분들이 오랜 시간 junk DNA로 알려져 왔다. 하지만 지난 10년간 개발되어온 차세대 시퀸싱과 같은 high throughout 기술들로 단백질을 생성하지 않는 게놈을 더 정밀하게 분석할 수 있게 되었다. 이 기술을 이용한 연구들은 놀랍게도 게놈의 2% 미만만이 단백질을 생성하지만, 상황에 따라 게놈의 많은 부분들이 단백질을 생성하지 않더라도 전사된다는 사실을 알아냈다. 단백질을 생성하지 않는 전사체들, 즉 non-protein-coding transcripts 중, long noncoding RNAs (lncRNAs)이라 불리는 그룹이 많은 관심을 받기 시작했다. lncRNAs는 단백질을 생성하지 않는 200 뉴클리오티드 보다 긴 RNA를 의미한다. lncRNAs 는 게놈 내에 단백질을 생성하는 유전자들과 겹치는 intergenic region에서 전사된 전사체들, enhancer RNAs (eRNAs), 그리고 sense 또는 안티센스 전사체들로 이루어져 있다. lncRNAs는 cistrans로 전사를 조절하고, 세포핵 내 구조에도 영향을 미치고 단백질들과 RNA들의 역할을 조절하는 등, 다양한 기능을 할 것이라고 제안되어 있다.

포유류에서는 lncRNA의 개수가 2만 개에서 10만 개 즈음 될 것이라고 예측하고 있다. 이렇게 많지만, 대부분의 lncRNA는 생물학적 기능과 역할이 불분명하다. Enhancer와 promoter 같은 전사 조절 요소들이 전사를 양방향으로 시작할 수 있다는 것이 밝혀진 만큼, 많은 수의 lncRNAs가 enhancer와 promoter에서 시작하지만 정작 전사된 DNA의 서열과는 관계없는 역할을 하리라 생각된다. 이렇게 생각할 수 있는 근거로 많은 lncRNAs가 소량으로 전사되고, 세포핵 내에 위치해 있으며, 전사된 DNA의 서열을 보존하지 않는다는 것을 들 수 있다. 최근에 발표된 연구결과를 보면 lncRNAs자체보다 lncRNAs가 DNA로부터 전사되는 과정 또는 lncRNAs가 게놈에 위치한 곳에 존재하는 DNA 요소들이 실제로 게놈의 전사 조절 요소들이 되지 않을까 생각된다. 또한 이런 연구결과들로 미뤄볼 때, RNA가 존재한다는 그 자체 또는 RNA가 전사된다는 증거가 더 이상 그 RNA가 자동적으로 역할이 있을 것이라고 암시하진 않는다는 것을 알 수 있다. 따라서 연구자들은 역할이 분명하게 밝혀지기 전까진 주석이 달린 몇만 개의 lncRNAs 중 전사된 DNA로부터 독립적으로 역할하는 lncRNAs는 소수라 생각해야만 할 것이다. 하지만 워낙 예측된 lncRNAs의 숫자가 많은지라 그중 소수만이 기능이 있다 하더라도 몇백 개 또는 몇천 개의 멤버로 이루어진 주요한 gene class가 될 것이다.

이 리뷰 논문에서는 현재 알려진 lncRNAs의 기능들을, lncRNA가 전사되는 주변의 염색질 구조와 유전자의 발현을 조절하는 cis 조절방법, 그리고 lncRNA가 전사되는 부분으로부터 멀리 떨어진 곳에 위치한 유전자의 발현을 조절하는 trans 조절방법으로 구분지어 정리할 것이다 (그림 1). lncRNAs의 유전자 조절 메커니즘은 기능이 엄증된 몇몇 lncRNAs를 바탕으로 성립시킬 것이며, 엄증하는 연구과정을 바탕으로 앞으로 어떻게 체계적으로 lncRNAs의 역할을 밝힐 수 있는지 제의할 것이다.


lncRNA의 역할은 크게 cis와 trans로 나뉜다.
그림 1. lncRNA의 역할은 크게 cistrans로 나뉜다.
lncRNA와 동일한 염색체에 위치한 유전자에만 직접적인 영향을 미칠 때 cis로 역할을 한다고 정의한다. lncRNA의 직접적인 영향이 lncRNA가 위치한 염색체를 벗어나는 순간 trans로 역할을 한다고 정의한다. 여기서 lncRNA의 영향이란 단순히 유전자의 발현 정도가 아닌 그 유전자의 모든 기능/역할을 증감시킬 수있는 포괄적인 영향을 뜻하며, 간략하게 단백질 코딩 유전자와 결합된 Pol II 위에 +/-로 표현하였다.


2. 주변 유전자의 전사를 조절하는데 있어서 lncRNAs의 역할

lncRNAs는 기능을 바탕으로 크게 2 분류로 나눌 수 있다; 주변 유전자의 전사나 염색질의 구조를 조절하는 cis로 조절하는 IncRNAs, 그리고 주변 유전자나 염색질 외 세포 내 많은 역할에 관여하는 trans로 조절하는 IncRNAs가 있다 (그림 1). cis로 게놈을 조절하는 lncRNAs 경우 lncRNA 그 자체로부터 오는 역할과 lncRNA가 전사된 위치의 DNA으로부터 오는 역할을 분리하기가 쉽지 않다. cis로 게놈을 조절하는 lncRNAs는 3가지의 조절방법을 상상할 수 있다 (그림 2).
A. lncRNA가 직접 유전자 조절 요소들을 끌어모으고, 그들의 기능을 조절함으로써 주변의 유전자들의 전사를 조절한다.
B. lncRNAs가 DNA로부터 전사, 또는 전사 중 접합(splicing)되는 과정에서 lncRNAs의 서열과는 상관없이 lncRNAs가 주변 유전자들의 전사를 조절한다.
C. lncRNAs가 생성되는 과정, 또는 서열과는 별개로, lncRNAs가 전사되는 promoter 또는 lncRNAs가 위치한 게놈에 있는 유전자 조절 요소들이 주변 유전자를 조절한다.


lncRNA가 cis로 역할하는 방법들
그림 2. lncRNA가 cis로 역할하는 방법들
A) lncRNA 전사체가 염색체를 활성화/불활성화 시켜서 주변 유전자의 발현을 조절한다. (예, Xist)
B) lncRNA가 전사되는 또는 lncRNA 전사체가 splicing되는 과정에서 전사 인자나 splicesome이 주변 유전자의 발현을 조절한다. (예, Airn/Igfr2, linc1319/Blustr, Uph/Hand2)
C) lncRNA내에 위치한 enhancer와 같은 기능적인 유전자 조절 요소가 주변 유전자의 발현을 조절한다. (예, lincRNA-p21/Cdkn1a, linc1536/Bend4)


2.1. lncRNA의 서열에 따른 주변 유전자의 cis 조절방법

lncRNAs의 가장 유력한 기능 중 하나가 lncRNA가 위치한 염색줄을 억제 또는 활성화시키는 것이다 (그림 2A). 가장 유명하고 잘 알려진 예로 Xist (X-inactive specific transcript Xist)를 들 수 있다. 여성 포유류의 배아 발달 초기과정에서 두 개의 X 염색체 중 하나가 복용량 보상, 즉 dosage compensation을 위해 억제된다. 이 중요한 과정은 하나의 X 염색체에서만 Xist가 전사되는 것을 필요로 하며, 억제된 염색체는 비활성화된 X 염색체(Xi) 가 된다. Xist가 전사되면 Xi가 될 X 염색체에 골고루 퍼진 후, 염색체를 핵 내 변두리에 몰아놓고, 전사를 억제하는 마커를 뿌려 놓아, 결국엔 염색체를 거의 전부 비활성화시키는 것이다. Xist를 통한 X 염색체의 비활성화는 다른 리뷰 논문에서 많이 다뤘기에 여기선 간략하게 언급만 한다. ~17-kb Xist 전사체는 염색체를 억제하는 기능을 지닌 6개의 반복되는 요소들, A-F repeat들로 이루어져 있다. 과거에 실행된 유전학 실험들이 Xist 전사체의 서열이 X 염색체의 비활성화에 중요함을 밝혔지만, Xist 리보 핵산 단백질(RNP) 이 어떤 메커니즘으로 X 염색체를 비활성화시키는지는 당시 생화학 실험들의 상반된 결과 때문에 해석이 어려웠다. 그 당시에는 몰랐지만 Xist RNP을 연구하기 위해 사용한 표준 RNA immunoprecipitation (RIP) 실험과 시험관 내 결합 연구(in vitro binding studies) 실험들이 높은 위양성을 나타냈기 때문에다. 다행히도 최근에 개발된, RNA와 단백질이 결합된 상태에서 crosslinking 한 후 denature 되는 조건 하에 RNP를 정제하는 방법과 진보적인 유전학(forward genetics) 을 이용한 실험들이 Xist 전사체가 어떤 단백질과 결합해 어떻게 X 염색체를 비활성화시키는지 밝히는데 많은 기여를 하고 있다. 아직 메커니즘에 있어서 Xist RNA가 직접적으로 polycomb repressive complex 2 (PRC2)를 모집하여 X 염색체를 Xi로 비활성화 시키는지는 논쟁의 여지가 있지만, 많은 연구결과들이 SMART/HDAC1-associated repressor protein (SHARP 또는 SPEN) 이 Xist A–repeat을 이용해 Xi가 될 X 염색체에 모집되고, 그다음 SHARP/SPEN-interacting protein silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptors (SMRT) 그리고 이와 상호작용하는 histone deacetylase 3 (HDAC3) 가 모집되어 X 염색체를 비활성화시키기 위한 첫 단계인 histone deacetylation을 유도하게 된다. Xist lncRNA가 이제 25년 이상 연구가 되었지만 아직도 기능을 이해하는데 있어서 논쟁이 있다는 사실은 cis-acting regulatory RNA들의 메커니즘을 이해하기가 그만큼 어렵단 증거가 되겠다. 동시에 최근 입증된 Xist lncRNAs의 기능을 밝히는 연구들을 보면 classical genetics가 어떻게 state-of-the-art 분자학 그리고 생화학 실험방법들과 같이 lncRNAs 의 역할과 기능을 밝히는데 사용될 수 있는지를 보여준다.

2.2. lncRNAs의 전사 또는 접합(splicing) 으로 일어나는 cis 조절방법

경우에 따라 lncRNA 의 위치로부터 RNA가 전사되는 과정이 주변 유전자를 조절하는데 중요하지만 lncRNA 의 서열이나 lncRNA 전사체의 성숙도나 완성도는 중요하지 않을 수도 있다. 이런 조절방식의 대표적인 예로 포유류의 Igfr2 유전자가 있다. Igfr2이 전사되는 방향의 반대 방향으로 전사되는 Airn (antisense Igfr2 RNA noncoding) 안티센스 lncRNA는 Igfr2 유전자의 단백질 코딩 부분 및 promoter와 겹치며, 아버지로부터 물려받은 Igfr2 유전자를 비활성화하는데 필요하다. Airn 전사체가 Igfr2 promoter와 겹치는 서열 전후에 전사를 중단시키는 polyA를 각 뉴클레오티드 위치마다 일일이 주입하면서 실험해 본 결과, Barlow와 동료들은 AirnIgfr2를 억제하는 기능은 Airn의 서열에 상관없이, AirnIgfr2 promoter를 통해 안티센스로 전사되며 Igfr2의 전사를 간섭할 수 있는 과정이 필요하다는 것을 밝혔다.

lncRNA가 전사되는 위치에 다른 유전자들이 겹쳐있지 않다고 하더라도, lncRNA가 주변 유전자 promoter의 RNA polymerase II (Pol II) 점유 정도, 염색질의 전사 가능 상태, 그리고 transcription factor가 promoter나 enhancer에 결합하는 정도를 바꿀 수 있다 (그림 2B). 대표적인 예로 linc1319 또는 Blustr (bivalent locus [Sfmbt2] is upregulated by splicing and transcribing an RNA) 가 있다. Promoter를 삭제하거나, 전사를 중단시키는 polyA를 주입하거나, Blustr의 첫 번째 splicing이 일어나는 5’ 위치에 점 돌연변이를 일으켰을 때, 근처의 Sfmbt2 유전자의 발현 정도가 줄어들었다. 이 Sfmbt2 유전자의 발현을 조절하는 cis 조절효과는 Blustr 전사체의 길이와는 상관관계를 보였으나, lncRNA Blustr가 전사되는 시점부터 exon과 intron들을 차차 돌연변이 시켜본 결과 Blustr의 서열과는 상관이 없다고 밝혀졌다. 하지만 이 실험들은 첫 번째 exon을 삭제하거나 변화시켜지 않았기에, 적어도 첫 번째 exon은 RNA로 전사되었을 때 기능이 있을 가능성이 남아있다. Blustr의 손상된 전사과정과 splicing은 Sfmbt2 promoter 염색체의 histone 3 lysine 4 trimethylation (H3K4me3)을 줄이고, histone 3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3)을 증가시키고, Sfmbt2 유전자의 전사 시작 시점에 RNA polymerase의 결합 정도를 줄이는 역할을 한다. 따라서 Blustr의 RNA 전사와 splicing은 주변 유전자의 발현을 허용하는데 필수이다.

Upperhand (Uph)는 Blustr와 비슷하게 전사체 그 자체는 상관없지만 전사과정이 주변 유전자의 발현을 조절하는 다른 예이다. Uph는 심장발달과정에 중요한 Hand2 전사 인자를 발현시키는 bi-directional promoter로부터 전사된다. Uph의 서열은 다양한 종들간 보존되어있지 않지만, 반대로 잘 보존되어온 Hand2 enhancer가 포함된 지역으로부터 Uph 전사체가 만들어지는 현상은 다양한 종들간 잘 보존되어왔으며 포유류 간 흔하다. Uph의 전사가 중간에 중단이 되도록 polyA를 전사 시작 지점 가까운 곳에 삽입할 경우, Hand2의 발현이 저하되면서 쥐의 배아 치사로 이어졌다. 하지만 tdTomato 유전자를 비슷한 지점에 삽입하였을 때는 Hand2의 발현 정도에 이상이 없었다. 나아가 세포주에서 완성된 Uph 전사체를 antisense oligonucleotides (ASOs)를 이용하여 저하시켜도 Hand2의 발현 정도를 바꾸지 못했다. 비록 이 연구결과를 토대로 완성된 Uph lncRNA는 기능이 없다고 정의할 수는 있겠지만, ASOs가 적절히 억제하지 못하는 전사 초기단계의 Uph lncRNA까지 Hand2의 발현 조절에 기여하지 않는다고 말할 수는 없다. 쥐에서 완성되지 않은 Uph의 전사 중단은 Hand2 enhancer가 위치한 염색질의 histone 3 lysine 4 monomethylation (H3K4me1) 과 histone 3 lysine 27 acetylation (H3K27ac) 레벨을 떨어트려 GATA4 전사 인자가 Hand2 enhancer에 결합하는 정도를 낮추고, 따라서 Hand2의 발현을 저하시켰다. 특히 완성된 Uph 전사체는 대부분 세포질 내에 위치해 있는 것으로 발견되었다. 이 결과는 여태까지 얘기한 Uph의 기능들 외 추가적인 Uph의 기능들을 암시할 수도 있지만, 또 한편으로는 lncRNA의 역할과 기능을 추측할 때 단순히 lncRNA의 세포 내 위치로만 추측하지는 말아야 할 것이라는 얘기가 된다.

DNA 내 유전자 조절 요소들에서 전사되는 RNA들은 전사인자들이 보편적으로 전사하는 DNA와 더 잘 결합할 수 있도록 도와주는 역할을 한다고 제안되어왔다. Sigova와 동료 연구자들은 promoter와 enhancer들로부터 양방향으로 계속 전사가 된다고 밝혀진 결과를 바탕으로 전사 인자가 DNA와 DNA로부터 전사된 RNA, 둘 다와 결합하면 전사하는 DNA와의 관계를 더 강화시킨다고 생각했다. 실제로 언제나 발현되어 있는 전사 인자 Yin-Yang1 (YY1)가 근처의 promoter나 enhancer, 그리고 전사된 RNA와 결합한다고 밝혀졌다. 전사 과정을 억제하면 YY1이 염색질과 덜 결합하였지만 Cas-9를 이용해 YY1의 target 유전자 promoter에 전사한 RNA를 매달아 놓으면 YY1이 염색질과 더 잘 결합하는 것을 관찰하였다. 이 “RNA를 이용한 전사 인자 잡아놓기” 모델이 과연 보편적인 메커니즘인지는 YY1 외의 전사 인자들도 이런 기능을 보이는지 확인해야겠지만, 유전자 조절 요소로부터 전사된 RNA가 어떻게 그 조절 요소와 전사 인자들이 더 강한 관계를 맺게 하는 긍정적인 피드백 루프를 형성하는지 설명할 수 있는 가장 강력한 모델일 것이다. 아마도 특정 서열로 한정된 RNA와만 결합할 수 있는 전사 인자보다는 다양한 RNA와 결합할 수 있는 전사 인자가 이 메커니즘을 이용할 수 있을 것이다. 특히, histone methyltransferase PRC2가 이런 특정 서열에 국한되지 않게 RNA와 결합을 할 수 있는 점이 관찰된 바 있기에 PRC2와 타겟 DNA의 결합이 여기에 설명된 것처럼 비슷하게 RNA의 전사 레벨에 의해 영향을 받을 것이다.

2.3. lncRNA Loci 내에 존재하는 기능적인 유전자 조절 요소들

lncRNA의 cis regulatory 역할이 lncRNA가 전사되는 과정이나 전사된 RNA의 서열 외에 lncRNA가 위치한 구역 내에 존재하는 유전자 조절 요소들로부터 일어날 가능성을 언제나 고려해야 한다 (그림 2C). 이런 예로 lincRNA-p21가 있다. lincRNA-p21의 유전자 조절 역할은 대체로 lncRNA 유전자 내에 위치한 전통적인 cis-acting 유전자 조절 요소들에 귀속되어 있다고 생각할 수 있다. lincRNA-p21는 인간과 쥐에서는 CDKN1A 유전자 부근에 위치한 유전자간 구역으로부터 전사된 후 핵 내에 자리잡는 전사체이다. 초기 연구결과에 따르면 lincRNA-p21는 DNA에 손상이 오면 p53와 같이 trans-acting하여 p53에 의해 조절되는 유전자들을 억제함으로써, 세포 사멸을 중재하는 것으로 나타났다. 이런 연구결과는 lincRNA-p21이 또 다른 trans-acting하는 역할이 있을 것으로 예측하는 많은 연구들을 촉진시켰다. 하지만 lincRNA-p21을 조심스럽게 분석한 결과 lincRNA-p21이 실제로 Cdkn1acis로 규제한다는 강력한 증거를 포착했다. 따라서 lincRNA-p21 기능 상실의 다운 스트림 효과는 Cdkn1a로부터 발현되는 단백질 p21의 감소에 의한 제2차적인 결과로 볼 수가 있다. 더 나아가 이 메커니즘은 lincRNA-p21trans-acting한다고는 보기 어려운 짧은 반감기(2시간 미만)와 적은 copy number(세포 마다 8개의 copy)로 뒷받침된다. 가장 최근의 lincRNA-p21 유전 분석은 lincRNA-p21가 발현되지 않는 조직에서도 lincRNA-p21 유전자 내에 위치한 유전자 조절 요소들이 lincRNA-p21 근처 유전자들의 발현 정도를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 이런 연구결과는 lincRNA-p21CDKN1A의 발현조절과 관련된 p53 binding site에서 유래하는 enhancer RNA라고 밝혀진 연구결과와 비슷한 일맥이다. 따라서 서서히 lincRNA-p21의 역할에 대한 일치된 연구결과들이 모이고 있다. lincRNA-p21cis 형식으로 근처 유전자들의 발현 정도를 조절하고, 그리고 특정한 경우 lincRNA-p21 안에 유전자 조절 요소들이 lncRNA의 전사와는 독립적으로 이 역할을 한다. 하지만 Dimitrova와 동료 연구자들이 lincRNA-p21를 ASOs로 줄이기만 해도 cultured murine fibroblasts 내에선 Cdkn1a의 발현을 감소시킬 수 있다고 명백히 보여준 만큼, 특정한 경우에는 lncRNA의 전사체, 아니면 최소한 전사과정이 lincRNA-p21의 유전자 조절 역할에 있어서 중요하다는 것을 알 수 있다.

lncRNA 내에는 근처 유전자들의 발현 정도를 조절할 수 있는 유전자 조절 요소들이 흔하게 존재한다. lncRNA loci가 근처의 유전자들을 주로 cis로 조절하는지, 그리고 그 역할이 유전자 조절 요소들에 의해 조절되는지 또는 lncRNA의 전사과정에 의해 조절되는지를 알기 위해 최근에 게놈 편집 기법을 hybrid mouse embryonic stem cell에 적용하여 근처 유전자들의 발현 정도를 allele specific manner로 관찰하는 실험을 하였다. 12개 중 5개의 lncRNA promoter와 6개 중 4개의 단백질을 코딩하는promoter를 삭제하였을 때 같은 allele에 위치한 근처 유전자들의 발현에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 또한, 전사를 일찍이 중단시키는 polyA를 주입하면서 근처 유전자들의 발현 정도에 미치는 영향을 관찰한 결과, 한 경우를 제외한 나머지 경우는 lncRNA나 단백질을 코딩하는 유전자의 처음 1~3개의 exon 외의 전사는 cis로 유전자를 조절하는데 중요하지 않다는 점을 알아냈다. 예를 들어, Bendr (Bend4-regulating effects not dependent on the RNA)라고 새로 명칭된 linc1536의 promoter를 삭제했을 때 옆에 있는 유전자 Bend4의 전사와 발현 정도가 급격히 감소하였다. 하지만 Bendr의 첫 번째 intron 안에 polyA를 삽입하여 Bendr의 전사를 막았을 때는 Bend4의 전사와 발현 정도가 변하지 않았다. 이 결과들은 Bendr locus와 이 리뷰 논문에서 언급하는 많은 cis-acting lncRNA loci에서 lncRNA의 전사과정과는 상관없이 유전자 내에 위치한 enhancer와 같은 요소들이 근처 유전자들의 전사와 발현을 조절한다는 것을 알 수 있다. 그렇지만, 처음 몇 개의 exon들이 진짜로 lncRNA의 역할에 관여가 있는지 없는지를 밝혀내기 위해서는 polyA의 삽입점 전에 위치한 exon들의 서열을 돌연변이시키며 주변의 유전자의 전사와 발현을 관찰하는 실험들이 필요하다.

3. trans로 역할을 발휘하는 lncRNA들의 기능

앞서 보여준 cis로 유전자 전사와 발현을 조절하는 경우 외에도 전사되는 장소를 벗어나 trans로 작용하는 lncRNA들의 예가 늘어나고 있다. 이런 lncRNA들은 크게 3종류로 나뉠 수 있다 (그림 3):
A. 염색질의 상태와 유전자의 발현을 조절할 수 있는 lncRNA.
B. 세포핵의 구조와 조직에 영향을 미칠 수 있는 lncRNA.
C. 다른 RNA나 단백질과 상호작용하면서 그들의 역할을 조절할 수 있는 lncRNA.


lncRNA가 trans로 역할하는 방법들
lncRNA가 trans로 역할하는 방법들
lncRNA가 trans로 역할하는 방법들
그림 3. lncRNA가 trans로 역할하는 방법들
A) lncRNA 전사체가 염색체를 불활성화시키는 마커들을 유지함으로써 유전자의 발현을 억제한다. (예, HOTAIR, lincRNA-EPS, SLERT)
B) lncRNA 전사체가 핵 내에서 구조적인 역할을 한다. Firre는 상염색체와 직접 결합하여 Firre가 전사되는 X염색체와 상염색체 간 상호작용을 유도한다. NEAT1MALAT1은 핵 반점들인 paraspeckle과 speckle에 위치하여 활발히 전사되는 유전자에 전사인자와 splicesome을 전달하는 역할에 일조하며 paraspeckle과 speckle의 유지에도 중요한 역할을 한다.
C) lncRNA 전사체가 단백질이나 RNA와 상호작용을 함으로써 단백질과 RNA의 기능을 조절한다. NORAD는 PUM1/2와 결합/분리하여 두 단백질의 translation inhibition 정도를 억제/활성화시키며, CDR1as는 miR-671, miR-7과 결합하여 miR-671의 분해가 miR-7의 기능을 필요한 위치에서 활성화시킬 수 있는 구조를 제공한다.


3.1. lncRNA들이 주변 유전자의 전사와 발현을 trans로 조절하는 방법

처음 trans로 유전자의 전사와 발현을 조절한다고 보고된 lncRNA는 포유류에서 볼 수 있는 ~2.2 kb 길이의 splicing되고 폴리아데닐화된 HOTAIR (HOX antisense intergenic RNA) 전사체이다. 4개의 HOX 유전자 클러스터 (HOXA, HOXB, HOXC, 그리고 HOXD)로부터 생성되는 HOX 전사인자 들은 많은 생물들의 발달 과정에서 위치 정체성과 분화를 담당하는 전사인자들이다. 앞서 초파리에서는 단백질을 생성하지 않는 RNA들이 HOX 유전자의 발현을 cis로 조절할 수 있다고 보여줬지만, Rinn과 동료들은 HOTAIR가 멀리 떨어진 HOXD locus가 위치한 염색질을 억압적인 상태로 유지하는 데 필요하다는 놀라운 연구결과를 발표했다. 후에 진행된 연구에서는 lncRNA과 염색질의 상호작용을 매핑하는데 쓰이는 “RNA를 이용한 염색질의 분리” (ChIRP: chromatin isolation by RNA purification) 라는 기술을 이용해 HOXD 클러스터 내에 HOTAIR의 결합 사이트가 있다는 것을 밝혔다. siRNA들을 이용한 HOTAIR의 depletion은 HOXD 유전자들의 전사를 활성화시켰으며 억압적인 염색질의 표지인 H3K27me3를 감소시켰다. 그 외에도 RIP과 바이오티닐화된 RNA의 풀 다운 assays 를 이용해 억압적인 염색질의 표지인 H3K27me3를 깔아놓는 PRC2의 일부분과 HOTAIR의 상호작용을 탐지하였다. 이런 연구결과들은 억압된 염색질 상태를 수립하기 위해 HOTAIRHOXD locus에 염색질을 수정하는 복합체들을 모집하는 발판 역할을 하는 모델을 연상시킨다 (그림 3A). 하지만 이 모델에 부분적으로 문제점이 있을 수 있는 이유는 모델의 기반이 된 연구 결과들이 발표된 이후 앞서 말했듯이 RNA-단백질의 상호작용을 연구하는데 있어서 쓰인 기술들의 약점들이 밝혀졌기 때문이다. in vitro에서 실행되는 binding assay와 RIP실험들은 위양성 상호작용을 암시할 수 있고 유독 PRC2가 RNA와 무분별하게 결합할 수 있다. 더 나아가 최근 연구결과에 따르면 human breast cancer cell에서 HOTAIR를 과발현시켰을 때 PRC2가 필요하지 않은 방식으로 몇 개의 유전자들이 억제된다고 발표되었다. 또한 HOTAIR가 luciferase reporter locus로 가이드 되는 Tethering 실험들을 통해 HOTAIR의 모집은 전사를 억제하기에 충분하며, PRC2를 필요로 하지 않는다고 밝혀졌다. 아직도 많이 상용되는 가설은 초반의 HOTAIRXist의 mechanistic 연구결과를 토대로 lncRNA의 주된 기능은 염색질을 복구하는 복합체들을 필요한 유전자로 모집하는 것이기에 이 가설을 재증명해주는 새로운 연구결과들을 주목할 만하다. 어쨌든 간에 이제는 HOTAIR와 다른 lncRNA들이 목표된 유전자를 조절하는 메커니즘에 있어서 많은 질문들이 남아 있음을 알 수 있다. RNA와 단백질의 상호작용을 밝히는데 있어서 결과를 신뢰할 수 있는 새로운 기술들이 남아있는 불확실한 점들을 해결하는 데 도와줄 것이다.

HOTAIR의 발견 이후, 추가로 많은 lncRNA들이 유전자들의 전사를 trans로 조절할 수 있다고 알려졌다. 두 예시를 통해 lncRNA들이 trans로 전사를 조절하는 메커니즘들이 얼마나 다양한지를 보여주겠다. 첫 예시는 쥐의 적혈구 생성시 유도되는 2.5 kb 길이의 splicing되고 폴리아데닐화된 lncRNA, lincRNA-EPS (lincRNA erythroid prosurvival, annotated as Ttc39aos1)이다. 시험관 내에서 적혈구 전구체의 lincRNA-EPS를 다운시켰을 때 적혈구 전구체가 사멸하였다. 반대로, 적혈구 전구체에서 이종의 lincRNA-EPS를 인위적으로 발현시킨 결과 적혈구 전구체의 사멸을 억제하였다. 이 중요한 결과는 lincRNA-EPStrans로 유전자의 발현을 조절할 수 있다는 증거가 된다. 아직 Pycard라는 세포사멸을 유도하는 유전자의 발현 조절 메커니즘이 밝혀진 것은 없지만 lincRNA-EPS의 세포사멸 억제기능은 적어도 부분적으로 Pycard의 발현을 억제하기에 나타나는 속성이라고 생각되어 왔다.

후속 연구에서 lincRNA-EPS는 지질 다당류(LPS: lipopolysaccharide) 같이 염증을 일으키는 자극에 노출된 대식세포에서 하향 조절되었다고 밝혀졌다. 쥐에서 lincRNA-EPS가 위치한 4 kb 길이의 유전자를 삭제한 결과, 대식세포에서 면역 반응 유전자들(IRGs: immune response genes)이 상향 조절되어 LPS를 투여했을 때 과민하게 반응해 endotoxin shock이 쉽게 유도되었다. 두 증거가 lincRNA-EPStrans로 역할하기에 이런 성향을 나타난다고 뒷받침한다. 첫째, lincRNA-EPS 유전자의 삭제가 주변 유전자들의 발현에 영향을 끼치지 않았기에 lincRNA-EPScis로 작용한다고 보기가 어렵다. 둘째, lincRNA-EPS가 삭제된 대식세포에서 유도되는 IRGs의 발현이 retrovirus를 이용한 lincRNA-EPS의 인위적인 발현에 따라 감소하였다. 메커니즘의 측면에서는 RNA와 염색체의 상호작용을 엄격히 구분해 낼 수 있는 RNA antisense purification (RAP)의 실험 결과에 따르면 lincRNA-EPS가 억제하는 유전자들의 promoter와 직접 상호작용한다고 보인다 (그림 3A). 그리고 그 유전자들의 전사를 억제하는데 있어서 lincRNA-EPS가 heterogeneous nuclear RNP (hnRNP) L와 직접 상호작용해서 억제할 유전자들의 promoter에 모집하는 것이 중요하다고 제안되었다. 그렇다면 각 대식세포에서 ~11개 정도 밖에 발현되지 않는 lincRNA-EPS는 몇 개 안되는 유전자들에게만 직접적으로 상호작용을 보일 수 있다고 생각할 수 있으며 lincRNA-EPS에 의한 IRGs의 발현 변화는 lincRNA-EPS의 간접적인 영향일 수 있다. 더 나아가 lincRNA-EPS와 목표되는 promoter간의 특정한 상호작용이 어떻게 일어나는지는 밝혀진 바가 없다. 마지막으로, 쥐와 인간의 lincRNA-EPS가 전사되는 위치는 두 게놈이 굉장히 흡사한 유전자 구역에서 전사되지만 두 lincRNA-EPS 전사체들의 서열은 많이 다른 것으로 나타났다. 이 결과를 해석하면 lincRNA-EPS가 인간과 관련되지 않은 쥐의 혈통에서만 특별히 유전자 조절 기능을 습득하였는지, 그리고 그렇다면 인간 세포 내에서도 쥐의 lincRNA-EPS와 비슷한 역할을 하는 lncRNA가 존재하는지 생각해 볼 수 있다.

lncRNA에 의해 trans로 일어나는 유전자의 발현 조절은 Pol II (RNA polymerase II)에 의해 전사되는 유전자로만 국한된 것이 아니다. 최근에 발견된 SLERT (small-nuclear-RNA [snoRNA]-ended lncRNA enhances pre-ribosomal RNA transcription) 는 Pol I (RNA polymerase I) 에 의한 전사에 영향을 미친다 (그림 3A). SLERT는 Pol II에 의해 전사되는 전사체들의 intron으로부터 만들어지고 5’ 과 3’ 에 snoRNA 선구체의 서열에 의해 마무리된, 구조적으로 독특한 lncRNA들을 대표한다. 694 뉴클레오티드 길이의 SLERT 경우, 성숙한 lncRNA는 양 끝이 인간 TBRG4 유전자로부터 만들어진 box H/ACA snoRNAs으로 마무리가 되어 있다. CRISPR를 이용해 TBRG4의 발현은 보존시킨 채로 조심스럽게 SLERT를 knockdown하고 이종의 SLERT를 인위적으로 발현시켜 본 결과, SLERT가 Pol I에 의한 pre-rRNA의 전사를 trans로 향상시키는 것을 알 수 있다. 역할에 부합하게, SLERT는 pre-rRNA의 전사가 일어나는 핵소체 내에 상당히 높은 레벨로 존재한다. 또한 Pol I 의 전사 기능을 억제하는 DDX21과 상호작용한다는 것을 프로테오믹스 실험들을 통해 밝혔다. 놀랍게도, 핵소체 내에 존재하는 Pol I를 DDX21가 감싸서 Pol I 의 전사능력을 제한하는 고리같은 구조를 이룬다고 super-resolution microscopy를 통해 보여줬다. SLERT가 이런 DDX21의 고리같은 구조에 모여 DDX21과 Pol I의 상호작용을 방해한다면 Pol I의 전사 기능을 SLERT가 촉진시키는 메커니즘이 될 수도 있다.

3.2. lncRNA들에 의한 세포핵 구조의 편성

어떤 lncRNA들은 세포핵의 구조에 영향을 끼쳐서 전사, RNA 가공 과정, 그리고 유전자 발현의 다른 과정들에 있어서 기능적과 공간적인 면으로 영향을 미치려고 한다. 이러한 lncRNA들의 역할은 세포핵 내에 매우 풍부하게 존재하는 핵 반점(speckles)에서 관찰되는 ~8 kb 길이의 MALAT1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, also called NEAT2)의 연구를 통해 처음 제안됐었다. 핵 반점들은 핵 내에 존재하는 유동적인 조직들로서 spliceosomal subunits, small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs), 그리고 serine-/arginine-rich (SR) 단백질 등, splicing에 필요한 여러 구성요소들이 모여있다. MALAT1은 핵 반점들의 조성에 필요하지는 않지만, 여러 splicing에 관련된 단백질들과의 직접적인 상호작용을 통해 핵 반점으로 모여진다. 또한 MALAT1이 lncRNA를 초기 pre-mRNA로 안내해 주는 단백질들과의 간접적인 상호작용을 통해 활발히 전사되는 유전자들에 모인다고 CHART (capture hybridization analysis of RNA targets), RAP-DNA (RNA-chromatin 상호작용을 매핑할 RAP), 그리고 RAP-RNA (RNA-RNA 상호작용을 매핑할 RAP) 실험 결과들이 알려준다. 따라서 MALAT1이 링커나 골격같은 구조로서 핵 반점들을 전사가 활발한 유전자들에 모이도록 유도하는 역할을 한다고 제안되었다 (그림 3B). MALAT1의 이런 기능이 splicing하는 단백질들을 막 전사된 전사체에 더 효율적으로 전달해주는 역할을 한다고 생각할 수 있지만, endogenous gene들의 발현과정에서 MALAT1이 그런 역할을 한다고 입증된 바는 없으며, Malat1이 삭제된 쥐들에게서 측정할 수 있는 정도의 비이상적인 splicing을 관찰할 수 없는 것으로 볼 때, MALAT1의 정확한 역할은 아직 불분명하다.

Malat1-/- 쥐들이 내피세포(endothelial cells)의 감소된 분열 증식에 따라 신생아 단계에서 망막혈관의 늦춰진 신생을 보이긴 하지만, Malat1은 쥐의 발달이나 생존에 있어서 필수적인 요소는 아니다. 추가로, 높은 수준의 MALAT1 발현은 폐암과 다른 암들의 안 좋은 예후와 관련 있으며 이런 in vivo에서 보이는 MALAT1의 전이증가 활동은 인간 세포라인과 쥐들을 이용한 Knockout 실험들을 통해 뒷받침되었다. 더 나아가, 치료 목적으로 Malat1을 억제하는 ASOs를 유방암 모델 쥐에 투여해본 결과, 명백한 독성 효과 없이 암세포의 더딘 분열, 증가된 분화률, 그리고 현저히 감소된 전이율을 보였다. MALAT1 ASOs의 이런 anti-cancer 기능들이 핵 반점 내에서 앞서 언급된 MALAT1의 역할을 방해하기 때문인지, 아니면 아직 밝혀지지 않은 MALAT1의 다른 기능들을 억제하기 때문인지는 현재 모른다. MALAT1의 발암성을 분자 기반적으로 이해하려는 연구를 통해 새로운 항암 치료법을 발견할 수 있기에 MALAT1의 메커니즘을 밝힐 수 있는 연구가 더 필요하다.

세포핵 내에 풍부하게 존재하는 NEAT1 (nuclear enriched abundant transcript 1, also known as MEN ε/β) 은 세포핵의 구조에 영향을 미치는 또 다른 lncRNA이다. NEAT1은 유전학적으로 잘 보존된 exon이 하나인 유전자로, 인간에서는 두 과정으로 성숙하여 3.7-kb 전사체 NEAT1_1와 22.7-kb 전사체 NEAT1_2, 이 두 isoform들로 완성된다. 흥미롭게도, NEAT1MALAT1은 바로 인접한 유전자 위치에서 전사되지만, 세포핵 내에서 뚜렷이 구분되는 서로 다른 조직들에 모인다. MALAT1은 핵 반점에 풍성하게 모여있지만, NEAT1은 핵 반점 주변에 분포된 전사와 RNA 가공과정에 중요한 단백질들이 모인 또 다른 유동적인 반점들(paraspeckles)에 모여있다. NEAT1은 이 유동적인 반점들에 위치하여 p54nrb/NONO, PSPC1/PSP1, 그리고 PSF/SFPQ 라는 단백질과 상호작용하며, 핵 내에 존재하는 다양한 조직들의 생성과 유지에 중요한 역할을 한다. NEAT1MALAT1과 같이 활발히 전사되는 유전자 위치와 연관되어 있다는 최근에 연구결과는 이 두 lncRNA가 각자가 속해 있는 핵 반점들을 갓 생성된 전사체들 근처로 옮겨 놓는 비슷한 역할을 한다고 제안하는 증거라 생각할 수 있다 (그림 3B).

Neat1Malat1와 비슷하게 쥐의 발달 과정 중 조금이라도 부족하면 비정상적인 발달이 확연하게 눈에 띌 정도로 절대적으로 필요한 단백질은 아니다. 실제로 베이스라인에서 Neat1과 paraspeckles들은 쥐의 특정 조직 내에서만 측정 가능하고 관찰된다. 이런 특정 조직은 난소가 배란되고 나서 생기며 프로게스테론을 분비하는 난소의 황체(corpus luteum)와 발달하는 유선이다. 따라서 이 두 조직은 Neat1-/- 쥐에서 결함이 있어서, 감소된 생식력과 젖의 분비 장애로 나타난다. NEAT1이 p53의 종양 억제경로에서의 역할도 밝혀졌다. NEAT1는 p53의 직접적인 타깃으로서, DNA에 손상이 오거나 DNA의 복제 시 암 유전자가 유발하는 스트레스가 생길 때 발현된다. Neat1이 결핍된 쥐의 fibroblast는 종양 형질 전환이 잘 일어나는 경향이 있으며, Kras가 없는 쥐에서 Neat1의 결핍이 췌장암 전구 병변을 잘 일어나게 한다. 한편으로는, Neat1-/- 쥐들은 화학적으로 유도된 피부암이 잘 생기질 않는다. Neat1의 경우에도, 구체적으로는 Neat1이, 더 나아가 포괄적으로는 paraspeckles들이, 어떻게 종양 형성과 조직의 발달에 관여하는지 Malat1의 경우와 비슷하게 확실하게 알려진 것이 없다.

Firre (functional intergenic repeating RNA element)는 세포핵의 구조에 영향을 미치는 독특한 부류의 lncRNA이다. 원래 쥐의 지방 생성에 관여하는 lncRNA들을 찾고자 screen한 실험에서 발견되었다. Firre는 핵 내에 위치하였으며, 고전적으로 hnRNP U와 상호작용할 수 있는 156 뉴클레오티드가 반복적으로 나타나고 있는 lncRNA이다. Firre는 X 염색체에서 전사되지만, X 염색체와 같이 비활성화되지 않고, Firre 전사체가 Firre 유전자와 상호작용하는 것으로 나타난다. mES에서 RAP를 이용해 게놈 전체에서 Firre과 염색질이 상호작용하는 위치를 검색해 본 결과, Firre이 유전적으로 연결되지 않은 5위치에서 검색되었다 (그림 3B). X 염색체상의 Firre와 이 5위치와의 trans 상호작용은 FISH (fluorescent in situ hybridization)로 확인하였다. Firre 유전자의 삭제나 hnRNP U의 감소가 이런 염색체간의 상호작용을 없애는 것으로 볼 때, Firre RNA는 멀리 떨어진 게놈의 영역들이 Firre의 전사위치에 모일 수 있도록 유도한다. mES 세포들에서 Firre lncRNA를 삭제하더라도 X 염색체상의 Firre와 상호작용하는 다섯 위치에서의 유전자들의 발현은 변함이 없었지만, RNA에 의해 유도되는 이 독특한 염색체간의 상호작용은 특정한 상황에서는 아마 유전자의 발현 등 규제 기능이 있을 수 있다. 이런 연구결과들은 lncRNA들이 더 광범위하게 세포핵 내에서 염색질들의 위치를 조절하는데 중요한 역할을 한다고 알려준다. 이러한 메커니즘의 대표적인 예로 Xist가 있다. Xist는 세포핵의 내부막에 위치한 lamin B receptor (LBR)과 직접적으로 상호작용하면서 비활성화된 X 염색체를 세포핵 내부의 변두리에 옮겨 놓는다.

3.3. lncRNA에 의한 단백질과 RNA들의 상호작용 조절

lncRNA들은 결합하는 단백질이나 RNA들의 활동력을 trans로 조절할 수 있다. 이런 lncRNA들의 특색은 그들의 target들과 정확한 stoichiometric한 결합 또는 상호작용을 해야지만 lncRNA들이 관측될 수 있을 만한 조절기능을 발휘한다는 점이다. 따라서, lncRNA들을 연구할 때는, 세포 내에 존재하는 lnrRNA들과 그들의 target 단백질이나 RNA들의 copy number를 조심스럽게 측정하여 제안하려는 메커니즘이 과연 가능한지를 파악하는 것이다. 이론적으로 이러한 lncRNA의 조절기능은 세포핵 내와 세포질 내에서 다 일어날 수 있지만, 여태까지 보여준 세포핵 내에서의 예들을 보충해주기 위해서 세포질 내에서의 예들만을 다루겠다.

lncRNA NORAD (noncoding RNA activated by DNA damage)는 RNA와 결합하는 단백질 PUMILIO1 (PUM1)과 PUMILIO2 (PUM2)의 미끼로서 기능을 한다 (그림 3C). PUMILIO라는 단백질들은 몇 mRNA의 3’ UTR에 위치해 있는 PUMILIO response element (PRE)라는 서열 UGUANAUA와 결합하는 종간 보존이 잘된 단백질이다. PUM1/PUM2이 mRNA와 결합을 하면, mRNA의 부식을 초래하고 단백질로의 번역을 막는다. NORAD는 주로 세포질 내에 풍부하게 존재하는 5.3-kb 길이의 splicing이 안 되고 폴리아데닐화된 전사체이다. NORAD는 ~500 뉴클레오티드 길이의 NORAD도메인을 5개 반복해서 지니고 있으며, 12개의 더 짧은 반복되는 서열들로 나누어질 수 있다. 이 반복되는 서열 안에는 우연이라고는 보기 힘든 15개의 완벽한 PRE들이 있다. 세포 내의 NORAD와 PUMILIO들의 개수를 정밀히 측정한 결과, NORAD에 있는 PRE들이 세포 내 모든 PUM1, PUM2와 결합할 수 있다고 밝혀졌다. 더 나아가 PAR-CLIP (photoactivatable ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation)이란 실험들은 NORAD가 인간 세포 내에서는 PUM2가 상호작용을 선호하는 RNA 파트너로 밝혀졌다. 실험을 통한 이런 관찰들은 NORAD가 PUM1/PUM2가 다른 mRNA와 결합하는 것을 방해하는 조절분자 역할을 한다고 제안한다. NORAD의 5’에 polyA 신호를 넣어서 비활성화시키거나, siRNA (short-interfering-RNA)를 이용하여 NORAD의 발현을 감소시키면 PUMILIO가 평소 이상으로 활성화돼 PUMILIO의 목표 mRNA들의 번역이 감소되는 것을 보면 앞서 밝힌 제안이 어느 정도는 맞다. NORAD가 억제된 세포들에서 PUMILIO를 추가로 억제하였을 때, PUMILIO가 조절하는 mRNA들은 세포의 유사 분열에 관여되는 mRNA들이 많기에 염색체의 불안정과 이수배수체같은 증상이 나타난다. NORAD라는 lncRNA가 어떻게 세포의 transcriptome 안에 그 많은 PUMILIO 와 결합할 수 있는 타겟들과 경쟁하고, PUMILIO를 가로챈 다음 RNP를 만들어내어 PUMILIO의 기능을 억제하는지 알려면 더 많은 연구가 진행되어야 한다.

PUMILIO 단백질들은 척추동물들과 무척추동물들 사이에 잘 보존되어 있는 반면, 종간 NORAD 비슷한 lncRNA들은 포유류에 국한되어 있다. 왜 포유류들은 이 메커니즘을 이용해 PU-MILIO를 조절하는지 아직 알려지지 않았다. 신기하게도, 포유류 세포에서 PUM1PUM2를 과발현하거나 삭제했을 때 이수배수체가 나타난다. 따라서 PUMILIO의 활동은 좁은 범위 안에 유지되어야지만 해로운 효과를 면할 수 있다. 이 아이디아가 신빈성있는 이유는, 쥐에서 두 Pum1 유전자 중 하나가 역할을 못 하면, 신경퇴화가 일어난다는 것이다. 따라서 NORAD의 가장 중요한 기능 중 하나가 PUM1과 PUM2의 버퍼로서, 자유자제로 떠다니는 PUM1과 PUM2의 수를 조절하여 이들이 target하는 전사체들에게 얼마나 영향을 미칠 수 있는지를 조절하는 것이다. 더 나아가, NORAD의 발현은 세포가 느끼는 DNA 손상과 저산소증과 같은 다양한 스트레스에 의해 상향조절되기에, NORAD라는 lncRNA가 상황에 따라 PUMILIO의 기능을 역동적으로 조절할 수 있다는 것을 보여준다. NORAD와 PUMILIO의 상호작용에 의한 PUMILIO의 기능 조절과 그것의 생체학적인 역할은 앞으로 더 연구되어야할 중요한 부분일 것이다.

lncRNA는 RNA와 결합하는 단백질 외에도 base pair할 수 있는 다른 RNA들의 활동과 양을 조절할 수 있다. 이런 lncRNA 중 대표적인 예로 microRNA (miRNA)를 조절하는 competing endogenous RNAs (ceRNAs)이 있다. ceRNA는 세포 내에 유효한 miRNA의 양을 조절한다고 제안되었으나, ceRNA 대 miRNA의 화학량이 이 메커니즘을 뒷받침할 수 있는지 의문이 있어 이 제안은 현재 논쟁의 여지가 있다. 그렇지만, 자연적으로 일어나는 cerebellar degeneration-related protein 1의 안티센스 전사체, CDR1as (ciRS-7이라고도 불린다)를 연구한 결과, 특별한 경우에는 lncRNA에 의한 miRNA조절이 가능한 것으로 밝혀졌다. CDR1as는 최근에 밝혀진 circular RNAs (circRNAs)로 전사체 후반부에 있는 5’ 위치가 전반부에 있는 3’ 위치와 재결합(splicing)을 통해 둥근 형태의 circular RNA로 만들어지는 RNA이다. 참고로, circRNA의 생성과정은 다른 논문에서 널리 리뷰되었기에 여기선 생략한다. CDR1as는 세포질 내에 풍부하게 존재하는 circRNA로서, 포유류에서는 종간 널리 잘 보존되어 있고, 뇌에서 고도로 표현돼 있다. CDR1as의 기능을 이해하는 단서는 CDR1as 자체의 독특한 서열에서 나왔다. CDR1as에는 miR-7과 상보되는 70개의 seed match 서열이 존재하고, miR671과 완벽히 상보되는 결합서열이 존재한다 (그림 3C). 인간과 쥐의 뇌, 그리고 인간 세포에서 진행된 CLIP 실험들이 miR-7과 Argonaute (AGO)의 합성체가 CDR1as와 광범위하게 결합한다고 밝혔다. CDR1as는 둥근 구조 때문에 5’ cap과 polyA tail이 없기에, miRNA에 의해 유도되는 탈아데닐화와 부패가 쉽게 오지 않는다. 따라서, CDR1as를 인간 세포와 zebrafish 태아에서 인위적으로 발현시켰을 때, 자유자재로 떠다니는 miR-7과 결합해 세포 내에 고립시킬 수 있어서 miR-7이 보통 억제하는 유전자들이 탈 억제된다. 반면에, miR-671는 쉽게 circRNA를 잘라 circRNA가 억제하는 miR-7의 기능을 회복시킬 수 있다. CDR1as가 miR-7을 억제하는 기능이 있는 것이 밝혀졌음에도 불구하고, 최근에 Cdr1as knockout mice를 이용한 생체 실험에서는, CDR1as와 miR-7의 더 복잡한 관계를 볼 수 있다. 놀랍게도, Cdr1as를 삭제하면 miR-7의 발현이 감소되어, 보통 miR-7가 억제하는 유전자들의 발현이 증가하면서, 시냅스간 신경 전달을 방해하여 정신질환 증세를 나타나게 한다. 즉, Cdr1as는 생체적으로는 miR-7의 positive regulator로서 역할을 한다. 신경세포에서 single-molecule FISH로 Cdr1as를 관찰한 결과, Cdr1as는 세포체와 시냅스에서 관찰되었다. 이 말은 Cdr1as가 miR-7과 결합하여 비활성화된 상태에서 miR-7을 시냅스와 같이 세포 내 지정된 장소로 옮겨준 다음, miR-671에 의해 잘리면서 miR-7을 적절한 장소에서 활성화시킨다고 생각할 수 있다. 이 모든 결과를 종합해 나오는 모델에 따르면, miR-7과 Cdr1as의 결합 그리고 이동이 miR-7의 안정된 발현에 중요한 역할을 한다. 이 모델을 증명하고 포유류 내에서 Cdr1as가 정확히 어떻게 miRNA들의 활동을 조절하는지 알기 위해서는 앞으로 연구가 더 필요하다.

4. lncRNA유전자 위치의 실험적인 해부

앞으로 전개될 lncRNAs의 연구를 체계적으로 지도하고자, lncRNAs가 유전자 발현을 조절하는 방법, 즉 cis로 조절하느냐, trans로 조절하느냐를 기준으로 나눈 뒤, 이론적으로 lncRNAs의 기능을 밝히기 위한 실험 접근 방법을 아래와 같이 정리하였다 (그림 4).

4.1. lncRNA 유전자 위치의 식별과 정의

lncRNAs를 더 연구하기 위해 선택하는 계기는 보통 lncRNA유전자가 위치한 장소가 발달, 생체기능, 아니면 질병상태와 연관이 있기 때문이다. 예를 들어, 많은 lncRNAs이 발달이나 세포분화 과정에서 동력적인 발현 레벨을 보인다. 암과 같은 질병에서 많은 lncRNAs의 발현 레벨에 변화가 있거나, 유전자 수(copy-number)에 변화가 온다. 비슷하게, 다양한 스트레스 상황에서나 신호 경로가 활성화 되었을 때에도 lncRNAs의 발현 레벨에 변화가 온다.

예를 들어 세포 증식과 약물 내성 같은 관심 있는 phenotype에 영향을 미치는 lncRNA loci를 식별하기 위해 CRISPR를 이용한 forward genetic screen들이 최근에 상호 보완적인 실험 방법으로 부각되기 시작했다. 중요한 것은, 개별 single-guide RNAs (sgRNAs)를 이용해 Cas9을 lncRNA loci에 보내 작은 indels (insertions-deletions)를 만드는 방법은 lncRNA 특성상 lncRNA의 기능을 충분히 비활성화시킬 수 없기에 전체적으로 확실하게 기능 손실이 나타나게 할 수는 없을 것이다. 확실히 lncRNA의 기능 손실을 나타나게 하기 위해서, lncRNA loci에 큰 deletion을 만들 수 있는 paired sgRNAs library가 사용되었다. 또 한 방법으로는, Cas9에 전사를 억제하는 단백질들을 결합(CRISPR interference [CRISPRi])하거나 반대로 전사를 활성화시키는 단백질들을 결합(CRISPR activation [CRISPRa])하여 게놈 전체적으로 lncRNA loss of function 스크린이나 gain of function 스크린을 실행할 수 있게 되었다. 이런 스크린의 결과를 해석하는데 있어서 조심해야 할 점은, 각각의 기술들이 lncRNA 유전자 외에도 enhancer 같은 유전자 조절 요소들도 비활성화 시키거나 극도로 활성화시킬 수 있다는 점이다. 따라서, 이런 스크린을 통해서 식별된 lncRNAs은 실제로 기능이 있는 lncRNAs인지 아닌지, 있다면 메커니즘이 뭔지 자세히 연구가 되어야 한다.


lncRNA들을 식별하고 실험을 통해 lncRNA들의 기능...
그림 4. lncRNA들을 식별하고 실험을 통해 lncRNA들의 기능을 이해하여 functional한 lncRNA들을 cis-acting인지 trans-acting인지 분류한 후, 그들의 functional mechanism을 구상할 수 있도록 저자들이 제안하는 실험순서와 실험들.


이 단계를 거쳐 실제로 기능이 있는 lncRNA가 식별이 되면, 관심 있는 세포 종류나 조직에서 lncRNAs 전사체의 구조를 철저히 정의해야 한다. 정의하는 방법으로 RACE (rapid amplification of cDNA ends) 또는 관련된 방법들로 전사체의 5’ 과 3’ 부분을 밝히고, RT-PCR (reverse-transcriptase PCR)을 이용해 증폭시킨 다음에 splicing 패턴을 밝힐 수 있다. 다른 방법으로, ENCODE (http://www.encodeproject.org)와 FANTOM (http://fantom.gsc.riken.jp)과 같이 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스, 그리고 만약에 알고자 하는 세포 종류와 조직에 대한 데이터가 존재한다면, 이런 데이터 베이스들을 통해 궁금해하는 lncRNAs의 구조를 정의할 수 있다. 이런 데이터들은 CAGE (cap analysis of gene expression), RNA-seq (RNA sequencing), 그리고 PAS-seq (polyA site sequencing)과 같이 전사체의 5’ 부분, splicing 패턴, 그리고 3’ 부분을 시퀸싱할 수 있는 실험 결과에서 나온다. 만약에 가능하면, Northern blotting이 예상된 크기의 전사체가 발현되는지 확인할 수 있다. 이런 실험들을 직접하라고 권하는 이유는, 특히 알고 싶은 lncRNAs 전사체가 특별한 세포 종류에서 처음 식별이 되었다면, 존재하는 주석들은 종종 high-throughput datasets을 자동으로 분석해서 나오기에 lncRNAs을 충분히 정의하기에는 부정확 또는 불완전하기 때문이다. 그리고 나중에 가능성 있는 lncRNAs의 메커니즘을 제안하기 위해서는 세포 내에 lncRNA 전사체의 copy number도 알아야 한다. 점차 주석이 달리는 lncRNAs이 실제로는 작은 단백질을 발현시키는 유전자라고 재식별이 되는 경우가 많기에, 식별된 lncRNAs이 전혀 단백질을 생성할 수 있는 능력이 없다는 것을 충분히 짚고 넘어갈 필요가 있다. PhyloCSF 같은 알고리즘으로 식별된 lncRNA 서열 안에 진화된 codon 대체 패턴을 분석해 보면 이 lncRNA가 단백질을 생성할 수 있는지 강력하게 예측할 수 있다. 이 방법은 단백질을 생성하는 유전자에서는 codon이 유지되는 또는 보수적인 아미노산으로 대체되는 점 돌연변이가 전사체를 중단시키는 돌연변이보다 만연히 흔하다는 사실을 이용한다. 식별된 lncRNAs의 번역된 아미노산 서열이 알려진 단백질 도메인(Pfam)과 비슷하다면, 단백질을 생성할 가능성이 높다. 마지막으로, ribosome profiling으로 식별된 open reading frame에 ribosome들의 흔적이 직접적으로 관찰되느냐를 놓고 단백질을 생성하는 전사체이냐, 아니면 단백질을 생성하지 않는 전사체냐를 구분할 수 있다.

4.2. cis로 작용하는 lncRNA의 기능을 조사하기

lncRNA가 식별되면, lncRNA의 기능을 이해하는 첫 단계는 이 lncRNA가 주변의 유전자만의 발현을 조절하는지, 즉 cis로 역할을 하는지, 아니면 전사된 위치를 떠나서 trans로 역할을 하는지 구분을 해야 한다. 이 구분은 loss of function과 gain of function 실험들을 통해 가장 잘 알 수 있다. lncRNAs의 loss of function을 이해하기 위해서는 우선 CRISPR/Cas9을 이용한 lncRNA의 promoter나 lncRNA 전부를 삭제하여 게놈을 변형시키는 실험들을 하면 된다. Exon이 여러 개인 큰 lncRNA 유전자 같은 경우, promoter를 삭제하는 것이 lncRNA 전부를 삭제하는 것보다 유전자 조절 요소들을 의도치 않게 삭제할 확률이 더 적기에 추천한다. 조사하는 lncRNA의 loss of function이 확실히 입증되면, 시퀸싱을 이용하는 RNA-seq, GRO-seq (global run-on sequencing), 또는 qRT-PCR (quantitative RT-PCR)을 이용해 근처의 유전자들의 전사와 정상상태에서의 발현 정도를 측정해야 한다. lncRNA의 기능이 상실된 후 근처 유전자들의 발현 정도에 변화가 있다면 lncRNA가 cis로 역할을 할 가능성이 크다. lncRNA가 knockout된 세포들에서 인위적으로 lncRNA를 발현시켰을 때, 발현 정도에 변화가 생긴 주변 유전자들의 발현 정도를 구원해낼 수 없다면, 식별된 lncRNA가 cis로 역할을 할 가능성이 크다.

위에 나열된 것처럼, 주변의 유전자 발현 정도를 조절하는 lncRNA는 lncRNA의 promoter나 lncRNA 유전자 자체 내에 위치한, 전사를 필요로 하거나 하지 않는, 유전자 조절 요소들이 주변 유전자의 발현 정도를 조절하는 기능을 담당할 수 있다. 다른 경우에는 전사된 RNA 자체가 기능이 있을 수 있다 (그림 2). 이 경우들을 구분하기 위해서 lncRNA의 5’ 끝에 polyA 신호를 삽입하는 것이 많은 것을 알려줄 수 있다. 이 실험 방법은 lncRNA의 전사를 중단에 멈추지만, lncRNA의 pro-moter와 유전자 내부에 존재하는 유전자 조절 요소들을 보존할 수 있다. 따라서 lncRNA의 5’ 끝에 polyA 신호를 삽입하였을 때 주변 유전자들의 발현 정도에 변화가 나타나면, lncRNA의 전사가 lncRNA가 역할을 하는데 중요하며, 전통적인 유전자 조절 요소들만이 lncRNA의 기능을 담당하지 않음을 알 수 있다. 이 실험을 할 때 유의할 점은, 긴 polyA 신호를 삽입하면 유전자 조절 요소들 간의 거리를 늘리기 때문에, 그 자체로 유전자 조절 요소들의 활동을 바꿀 수 있다. 이 가능성을 확인하기 위해 긴 polyA 신호를 삽입할 때는 돌연변이 시킨 polyA 신호도 삽입해서 비교해 봐야 한다. PolyA 신호를 삽입했을 때 lncRNA의 유전자 조절 기능이 사라진다면, 전사 자체나 lncRNA가 splicing되는 과정, 아니면 전사된 lncRNA 자체의 서열이 lncRNA가 유전자 조절 역할을 하는데 있어서 중요할 수 있다. 체계적으로 splicing 위치들을 방해하는 돌연변이가 만들어 보거나, lncRNA의 서열, 특히 exon들을 순차적으로 삭제하거나 바꿔보면, 앞서 말한 여러 가지의 가능한 메커니즘들을 차별할 수 있을 것이다. 예를 들어, lncRNA의 서열이 lncRNA가 역할을 하는데 있어서 중요하다면, exon를 삭제하거나 바꿨을 때, lncRNA의 역할에 큰 변화가 있을 것이다. 반대로, lncRNA가 역할을 하는 데 있어서 전사나 splicing 과정이 중요하다면, 서열의 삭제나 변경은 그다지 영향을 못 미치겠지만, splicing에 중요한 서열에 돌연변이가 일어나거나, 전사를 중단시키는 polyA를 삽입하면 lncRNA를 비활성화시킬 것이다. 짚고 넘어가야 할 중요한 점은, ASO나 siRNA를 이용한 knockdown이 종종 lncRNA 유전자가 기능이 있는 lncRNA를 생성하는지 판단하는 실험이 된다. ASO와 siRNA가 확실히 성숙한 lncRNA 전사체들을 감소시키지만, 이 방법들이 얼마나 막 만들어져 아직 성숙하지 않은 RNA들을 분열시켜 감소시킬 수 있는지는 아직 알려진 바가 없다. ASO와 siRNA가 성숙하지 않은 RNA들을 얼마나 감소시킬 수 있는지는 한번 고려해 봐야 할 중요한 문제점이다. 왜냐면 폴리아데닐화되는 과정이나 다른 메커니즘을 통해 성숙하지 않은 전사체가 분열되는 과정은 전사를 자연스럽게 중단시키는 계기가 되기 때문이다. 성숙하지 않은 전사체가 분열되면, 새로 생긴 5’ 끝이 5’ 으로부터 3’까지 엑소리보뉴클레아제 XRN2에 의해 분열되면서, 전사하는 Pol II 콤플렉스를 분해시키게 된다. 따라서 만약에 ASO나 siRNA가 아직 성숙하지 않은 RNA들에게 영향을 미칠 수 있다면, XRN2를 통한 메커니즘으로 전사 과정을 중단시킬 수 있을 것이다. 따라서, 우리 현재의 지식으로는 ASO나 siRNA를 이용해 lncRNA를 knockdown한 실험을 근거로 lncRNA가 역할을 하는데 있어서 전사과정 아니면 성숙한 전사체의 발현 둘 중에 어느 것이 중요한지 알 수가 없다.

lncRNA가 역할이 있는 lncRNA를 만들어 낸다면, lncRNA와 상호작용하는 단백질과 핵산들의 신분 식별이 중요한 다음 단계가 된다. 이 단계에서 crosslinking을 시키거나, 엄격하게 denaturing 되는 환경에서 lncRNA와 다른 단백질과 핵산들의 상호작용을 관찰하는 실험들이 native RIP나 in vitro pull-down assays보다 더 선호되는 실험 방법들이다. 다른 논문에서 포괄적으로 리뷰된 만큼, 최근에 개발된 실험 방법들은 endogenous RNA들의 상호작용하는 파트너들(단백질, 염색질, 그리고 다른 RNA들)을 식별하는데 높은 민감도를 보인다. 하지만 cis로 작용하는 lncRNAs는 세포 내에서 낮은 레벨로 발현되기에, 처음에는 새로 개발된 실험 방법들을 적용하기엔 어려울 수 있다. 따라서 정 필요하다면, lncRNA와 상호작용하는 후보 단백질들을 처음에는 cellular extracts에 있는 lncRNA를 in vitro pull-down 해 식별해 낼 수도 있을 것이다. 이런 경우에는 CLIP과 같은 crosslinking 방법들로 발견된 추정된 상호작용들의 유효성을 찬찬히 검사하는 것이 중요하다. 이렇게 cis로 작용하는 lncRNA과 결합하는 단백질 또는 핵산들의 신분을 식별하거나, lncRNA가 작용하는 염색질의 위치를 밝히면 타당성 있는 가설을 세워서 lncRNA의 메커니즘을 밝히는 연구를 계획하는 데 도움이 될 것이다.

4.3. trans로 작용하는 lncRNA의 기능을 조사하기

lncRNA를 삭제했을 때 주변 유전자들의 발현 정도에 변화가 없다면 lncRNA가 trans로 역할을 할 가능성이 높아진다. lncRNA를 삭제해서 사라진 lncRNA의 기능이 lncRNA를 인위적으로 발현시킴으로써 회복시킬 수 있다면, lncRNA이 trans로 역할을 한다는 증거가 된다. 앞서 설명한 대로, trans로 작용하는 lncRNA들은 다양한 기능을 할 수 있다 (그림 3). Cell fractionation과 fluorescent in situ hybridization를 통해 lncRNA의 subcellular localization을 밝힌다면 lncRNA의 기능에 대해 유익한 정보를 줄 수 있을 것이다. 앞서 말한 lncRNA와 상호작용하는 단백질과 핵산의 신분 식별이나, lncRNA가 모이는 염색질의 위치추적은 trans로 작용하는 lncRNA의 기능을 연구하는 방법들이며, 그렇게 밝혀진 결과들의 진위를 알기 위해서는 crosslinking을 사용하는 실험 방법들을 이용해서 확인을 해야 한다. 마지막으로, trans로 작용하는 lncRNA들을 연구할 때는 세포 내에 lncRNA 레벨을 정확히 측정해 제안된 메커니즘에 그 정보를 반영하는 것이 중요하다. 만약에 제안된 메커니즘에 lncRNA가 많은 수의 유전자를 조절하거나 세포 내에 풍부하게 발현되는 단백질과 결합하여 격리시킬 것이라고 나와 있다면 세포 내에 측정된 lncRNA 레벨이 이 가능성을 뒷받침할 수 있을 만큼 발현이 되어야 할 것이다.

5. 결론

지난 10년간 lncRNA 연구가 진행되어 오면서 noncoding RNA가 “전사과정에서의 잡음” 인지 아니면 실제로 생물학적인 역할이 있는 분자들인지 분쟁이 끊이지 않았다. 당연하겠지만 이 논쟁에 대한 보편적인 답은 없다. lncRNA가 기능이 있는지 (또는 없는지) 에 대한 답은 각각의 lncRNA를 연구해서만 알아낼 수 있다. 연구를 통해서 Enhancer와 같이 전사가 되지 않는 유전자 조절 요소들이 우리가 생각하던 것과는 달리 유전자 내에 광범위하게 분포되어 있고 널리 작용을 한다는 것을 알았듯이, lncRNA의 연구를 통해서 전사되는 lncRNA가 과연 “기능이 있는지” 생각해 볼 때, 보편적인 생물학적 기능의 정의는 잠깐 접어두고 새로운 관점으로 lncRNA연구를 접근할 필요가 있다. Occam’s razor가 말하듯이, 가장 간단한 가정이, 이 경우에는 “lncRNA의 전사는 유전자 조절 요소의 존재를 나타낸다”는 가장 간단한 가정이 맞는 가정인 경우가 많다. 더 복잡한 모델을 제안하려면, 순차적인 실험을 통해서 첫째, lncRNA의 전사가 lncRNA의 기능에 필요하고, 둘째, lncRNA의 전사체 자체가 역할이 있으며, 셋째, lncRNA 전사체가 전사되는 lncRNA 유전자의 위치를 벗어나 세포 내 다른 곳에서 역할을 하는지 확인해야 한다. 다행히도, genome editing과 RNP의 composition을 분석할 수 있는 생화학 실험들의 기술적 진보가 연구를 통해 lncRNA의 기능과 분자적 메커니즘을 제안하고 증명할 수 있는 능력을 향상시켜 주었다. 이 리뷰 논문에서 언급된 예시들을 보면 이런 엄격한 실험들을 순차적으로 이용하면 기능이 있는 lncRNA들을 식별하고, 그들의 분자적 기능을 밝힐 수 있다. 따라서 저자들은 계속된 noncoding transcriptome 연구가 우리가 아는 생체학과 질병에 대한 지식의 한계를 넓히고 예상치 못한 새로운 생물학적 지식을 알려줄 것이라 믿는다.

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이준규(2019). 실험으로 입증할 수 있는 기능을 토대로 한 long non-coding RNA의 분류법. BRIC View 2019-R08. Available from http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3201 (Apr 04, 2019)
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