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뇌종양에서의 단일 세포 RNA 시퀀싱을 이용한 전사체 연구동향
뇌종양에서의 단일 세포 RNA 시퀀싱을 이용한 전사체 연구동향 저자 임창임 (㈜마크로젠)
등록일 2018.11.15
자료번호 BRIC VIEW 2018-T37
조회 1206  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
일반적인 마이크로어래이(microarray)나 RNA 시퀀싱(RNA-seq) 분석방법과는 달리 단일 세포 RNA-seq (single cell RNA-seq, scRNA-seq) 분석법은 희귀한 세포군의 전사체(transcriptome) 특성을 분석할 수 있다는 장점 때문에 조직의 발생 및 줄기세포의 분화와 종양의 이질성(heterogeneity) 등을 분석하기 위한 목적으로 최근 부상하고 있다. 본서에서는 뇌종양 관점에서 scRNA-seq의 개요 및 이를 이용한 최신 신경 교모세포종의 연구 동향과 scRNA-seq 데이터베이스를 살펴보면서 향후 연구 방향을 가늠하고 신경 교모세포종과 관련한 정밀 의료에 필요한 치료 전략을 고찰하고자 한다.
키워드: 뇌종양, 이질성(heterogeneity), 전사체(transcriptome), single cell RNA-seq (scRNA-seq)
분야: Biotechnology
목차

1. 서론
2. 본론
3. 결론
4. 참고문헌


1. 서론

Microarray와 일반적인 RNA-seq 분석은 세포의 분자 상태를 정량화 하는 방법으로 개별 세포의 신호를 평균적으로 분석함으로써 수백만 개의 세포에서 평균값을 추정하는 것에 주로 의존한다. 그러나 종양을 구성하는 세포의 이질성(heterogeneity)을 고려할 경우, 발현을 나타내는 수치의 평균값을 측정하면 정상적인 조직 기능을 유지하고 질병 진행을 촉진하는 데 중요한 세포 집단 내에서의 내부 상호 작용 및 세부적인 차이를 간과할 수 있을 것이다. 따라서 위와 같은 분석방법은 조직을 구성하는 시스템의 분자 상태의 정보를 부분적으로만 제공한다. 이와는 다르게 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 개별 세포의 발현 프로파일을 제공한다. 유전자 클러스터링 분석을 통해 세포 집단 내의 희귀한 세포 유형을 식별할 수 있기 때문에 이질성을 가진 세포 집단의 각 부분의 특성을 규명할 수 있다. 특히 종양의 이질성은 누적된 돌연변이에 의한 것일 수 있지만 동일한 환경에서 유전적으로 동일한 세포조차도 유전자 및 단백질 발현 수준의 높은 변이성을 나타낸다. 그러나 세포 내에서 중요한 기능을 발휘할 수 있는 낮은 카피 수의 RNA는 통상적으로 사용되는 microarray나 RNA-seq 방법으로는 검출이 어렵거나 전통적인 평균값을 추정하는 분석법에서는 노이즈로 간주될 수도 있다. 반면에 다수의 단일 세포에 대한 scRNA-seq은 희귀한 낮은 카피 수의 RNA를 식별할 수 있으며 또한 개별 세포에서 전체 mRNA 집단의 카피 수 분포를 나타낼 수 있다는 장점이 있기에 최근 뇌종양을 포함하는 다양한 종양의 이질성 등을 분석하기 위한 목적으로 부상하고 있다 (그림 1, 2).

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그림 1. RNA 발현을 분석하는 microarray, RNA-seq과 single cell RNA-seq과의 차이점 개요.



이러한 단일 세포 RNA-seq은 어디에 사용될 수 있을까? 예를 들면, 암 환자의 말초 혈액에서 순환하는 종양 세포(circulating tumor cells, CTCs)의 수는 예후와 관련이 있는 것으로 나타났다. 그러나 분리된 CTCs는 종종 많은 수의 백혈구와 적혈구가 포함되어 있으므로 이들을 나열하고 특성화 하는 일이 쉽지 않다. 단일 세포 RNA-seq은 암세포를 정상적인 혈액 세포와 구별하고 동시에 종양 세포의 발현 프로파일을 얻기 위해 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 단일 세포 RNA-seq는 초기 인간 배아 및 성체 줄기 세포에서 희귀한 세포 유형을 분석하는 데에도 사용될 수 있는데 왜냐하면 두 세포 유형의 경우 모두 일시적으로 존재하며 현재 기술로 특징을 분석하기가 쉽지 않기 때문이다.

2. 본론

2.1 scRNA-seq을 이용한 종양 연구 동향

종양 조직을 사용한 단일세포 전사체 분석은 종양 조직과 접한 기저세포 및 면역세포와 함께 종양의 이질성을 분석하기 위해 사용되고 있다. 예를 들면, 유방암의 경우, 11명의 유방암 환자에서 얻은 515개의 단일세포의 전사체를 분석함으로써 암세포 이외의 세포들인 T세포, B세포 및 대식세포와 같은 면역세포가 미세환경을 구성하는 세포군이라는 것을 규명한 바 있다 [1].

종양의 중요 특징인 전이 역시 단일 세포 DNA sequencing을 통해 copy number variation을 분석한 경우도 있는데 대장암의 경우 APC 유전자의 “first hit”이 초기 progenitor clone에서 관찰되며 이후 primary 및 metastatic tumor의 기원이 된다는 것을 밝힘으로써 단일세포 수준에서 게놈을 분석한 바 있다 [2].

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그림 2. 신경 교모세포종에서의 single cell RNA-sequencing 개요.



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그림 3. 세포 표지법과 RNA-seq을 결합한 분석법의 개요.



2.2 Cell hashing

Cell Hashing은 여러 시료를 동시에 분석할 수 있는 multiplexing 기법으로 풍부하게 발현된 표면 단백질에 대한 일련의 서로 다른 바코드로 표지 된 올리고 표식 항체를 사용하여 고유한 샘플들을 pooling하여 하나의 scRNA-seq에서 분석할 수 있다. 세포 전사체와 함께 이들 tag를 sequencing으로써 각 세포를 고유 샘플에 할당하고 여러 샘플에서 발생하는 doublet를 식별할 수 있다는 장점이 있다 (그림 3).

2.3 scRNA-seq 분석 기기 및 서비스

Fluidigm C1, 10xGenomics 등을 이용하여 scRNA-seq을 분석하고 있다 (그림 4, 5). Fluidigm C1은 단일 세포 유전체학 연구를 위한 자동화된 솔루션으로 mRNA 시퀀싱, DNA 시퀀싱, 후성 유전학 또는 miRNA 발현 분석에 이용할 수 있다. 10xGenomics 역시 이질성 세포를 500 ~ 80,000개 이상의 세포를 구획화 하여 단일 세포 분석에 이용할 수 있다.
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그림 4. Fluidigm C1 개요.
[출처: https://www.fluidigm.com/applications/single-cell-analysis].


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그림 5. 현재 10xGenomics를 이용한 scRNA-seq 서비스를 제공하고 있는 ㈜마크로젠의 NGS 사업부.
[출처: 좌: http://www.macrogen.co.kr/ko/business/ngs_index.php, 우: 10xGenomics]



2.4 최근 신경 교모세포종 scRNA-seq 연구 동향

다음으로 뇌종양에서 single cell RNA-sequencing은 어떻게 이용되고 있는지 살펴보자.

신경 교모세포종(Glioblastoma, GBM)은 일반적으로 높은 수준의 세포 이질성을 보이며 나쁜 예후와 관련된 가장 흔한 악성 뇌종양으로 알려져 있다. 최근 lncRNAs는 종양 형성의 새로운 매개체로 부상하고 있다. scRNA-seq은 lncRNA 발현 프로파일에서 세포 변이 분석을 위한 좋은 방법을 제공하고 있다. 예를 들면, Wang 연구진은 5개의 원발성 GBM과 2개의 glioblastoma stem-like cell (GSC)의 380개의 세포에서 2,003개의 lncRNA의 발현 양상을 종합적으로 조사하여 개별 세포에 대한 lncRNA의 발현 패턴을 보여주었다. 또한 추가 분석 결과 lncRNA의 이질성과 splicing 패턴을 규명하였다. 더욱이, lncRNA 발현 변이는 외관상 똑같은 세포로 구성된 확립된 GSC 계통에도 편재되어 존재한다. GSC와 상응하는 분화된 세포 배양의 비교 분석을 통해 5개의 종양에서 줄기세포능(stemness)의 변화도를 밝힐 수 있는 31개의 차별적으로 발현된 lncRNAs로 줄기세포능을 가지는 특성을 확인했다. 또한, 분자적인 아형에 대한 lncRNA를 기반으로 각각의 종양은 4개의 아형을 나타내는 것으로 나타났다 [3]. 이처럼, scRNA-seq을 이용하여 lncRNA 이질성에 대한 체계적인 특성 규명은 lncRNA의 기능을 더 깊이 이해하고 가치 있는 바이오마커를 개발하며 나아가 신경 교모세포종에 대한 이해도를 향상시키기 위한 연구 토대가 될 것으로 생각한다.

한편으로 암 세포는 유전적 진화를 통해 종양 내의 암 줄기 세포(CSCs)가 종양 성장을 유도하고 분화된 세포를 만들 수 있는 발생 경로 및 후성적인 프로그램과 관련된 계층 구조도 중요한 역할을 하고 있다. 그러나, 악성 종양에서의 CSCs에 대한 증거는 아직 파악하기 어려운 것으로 보인다. Tirosh 연구진은 6개의 IDH1 또는 IDH2 유전자 돌연변이를 가지는 oligodendrogliomas에서 scRNA-seq를 사용하여 4,347개의 단일 세포를 분석하고 게놈 전체의 발현 패턴으로부터 발생 프로그램을 확인한 바 있다. 대부분의 암세포가 두 개의 특이적인 glial 프로그램에 따라 분화되는 것으로 나타났다. 반면에 일부 드문 세포군은 미분화되어 있으며 신경줄기세포의 발현 프로그램과 연관되어 있었다. 세포 증식과 관련한 발현 패턴이 있는 세포는 CSC가 주로 종양의 성장을 촉진시키는 모델과 일치하였으며 매우 풍부한 것으로 나타났다. 또한 CNV (copy number variation) 분석 결과 종양 내의 CNV 하위 클론이 비슷한 세포 계급 구조를 보임으로써 oligodendroglioma의 구조가 주로 발생 프로그램에 의해 결정된다는 것을 규명하였다 [4]. 이와 같이 단일 세포 분석은 단일 세포 수준의 분자적인 해상도를 규명함으로써 oligodendrogliomas를 구성하는 세포의 구조를 제공하고 질병 치료에 실질적인 영향을 미치는 암줄기세포 모델을 규명하는 데 유용하다.

그뿐만 아니라, 미세환경이 신경 교모세포종의 이질성에 어떤 영향을 주며, 특히 종양을 구성하는 암줄기세포와 미세환경이 어떻게 상호작용을 하는지를 이해하는 것은 신경 교모세포종의 치료를 위한 표적을 찾고 치료 반응을 이해함으로써 좀 더 효과적인 치료 전략을 수립하는 데 도움이 될 것이다[5]. 또한 암에서 대사(metabolism)는 새로운 관점에서 재검토되는 가장 흥미로운 옛 이야기 중 하나다. 20세기 초, Warburg는 많은 이차적인 원인의 질병에서 대사가 주요한 원인이라고 주장했으며, 이러한 의견은 종양 진화의 진정한 본질에 대한 현대적 관점에서 중요하다고 생각한다. 특히 종양 이질성의 복잡성이 유전적 관점에서 더 명확해 지면서 필연적으로 종양과 종양 미세 환경의 이질적인 대사 특성을 고려하는 것이 필요하다. 악성 신경 교모세포종은 종양의 고도로 혈관화 된 성질과 종양 내에서 좀 더 높은 악성 줄기세포가 존재하기 때문에 치료하는 것이 가장 어려운 것으로 알려져 있다. 신경 교모세포종 줄기 세포의 유지와 조절은 세포 내에서 특정 변화가 필요하고 신호 및 대사와 관련하여 고도의 종양 미세 환경을 필요로 한다. 또한 신경 교모세포종 내의 특정 니치(niches)는 높은 발암성 및 높은 대사성 특징을 갖는 줄기세포와 유사한 하위 집단의 생존을 돕는 것으로 알려져 있다. 니치 내에서 이를 유지하는 경로와 대사 의존성을 이해하면 신경 교모세포종 환자에서 종양 저항성과 재발을 다룰 수 있을 것이다 [6]. 따라서 이를 규명하기 위한 방법으로 scRNA-seq 분석법이 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

종양을 구성하는 하위 세포군은 종양 미세 환경의 구성 요소뿐만 아니라 악성 세포의 유전형 및 표현형에 따라 다르다. Venteicher 연구진은 165명의 환자 샘플의 bulk RNA-seq 프로파일과 16개의 환자 샘플의 14,226개의 scRNA-seq 프로파일과 결합하여 IDH (isocitrate dehydrogenase) 돌연변이 신경 교종에서 이러한 영향을 분석했다. IDH 돌연변이 성상 세포종과 oligodendroglioma 사이의 bulk 프로파일의 차이는 두 가지 종양 유형이 유사한 발달 계급 및 신경 아교세포 분화 계통을 공유하는 반면, 고유한 종양 미세 환경 및 특징적인 유전적 변화에 의해 주로 설명될 수 있다. 종양의 악성이 증가함에 따라 악성 세포의 증식, 더 많은 미분화된 신경아교 세포 및 종양 미세 환경에서의 발현 프로그램으로 대식세포가 증가한다는 사실을 발견했다. 이러한 연구는 scRNA-seq 분석법이 IDH 돌연변이 신경 교종에 대한 통합 모델을 규명하고 인체 종양을 구성하는 하위 군 간의 차이점을 분석하기 위한 일반적인 기틀을 제공한다고 할 수 있다 [7].

전사 인자 ZEB1은 상피 간엽 전환(epithelial-mesenchymal transition, EMT), DNA 수선, 줄기 세포 생물학 및 종양 유발 면역을 억제한다는 이유로 상피 암의 종양 생물학에서 주목을 받았지만 침윤 및 예후 가치와 관련하여 신경 교모세포종에서의 역할은 논란의 여지가 있다. Euskirchen 연구진은 266개의 원발성 뇌 종양에서 단일 세포 수준의 ZEB1 발현 특성을 분석했으며, EGFR 뿐만 아니라 Ki67, p53, IDH1 및 EGFR 면역 조직 화학 염색을 포함한 악성 신경 교종의 포괄적인 데이터를 제시했다. 신경아교종 줄기세포주에서 ZEB1 단백질 발현은 RNA-seq 전사체 프로파일에 기초한 유전자 발현 아형에 관해 그들의 원발성 종양과 비교하였다. ZEB1은 신경 교모세포종에서 광범위하게 발현되지만, 매우 가변적인 세포 일부에서만 발현된다. 신경 교모세포종에서 ZEB1 발현 정도는 EGFR 증폭 또는 IDH1 돌연변이가 있는 종양에서 더 높다. 종양 세포와 반응성 astroglia는 면역 세포가 아닌 ZEB1 양성 집단에 기여하는 것으로 나타났다. 이와 대조적으로, 신경 아교 세포주는 유전자 발현 아형과 무관하게 ZEB1을 지속적으로 발현한다. 본 연구 결과는 면역 침윤이 ZEB1의 차별적인 발현에 기여하고 bulk ZEB1 발현을 다르게 해석할 수 있음을 보여주었다 [8].

신경 교모세포종의 악성도는 부분적으로 하위 클론 내 유전형 및 표현형의 다양성에 기인할 수 있다. 따라서 신경 교모세포종의 재발을 유도하는 분자 경로를 확인하는 것은 진단과 예후의 특성 규명을 통한 정밀 의료의 발판을 제공할 수 있다. Chen 연구진은 재발되는 신경 교모세포종의 분자적 특성을 확인하기 위해 단일 세포 전사체, 즉 환자의 원발성 및 재발 신경 교모세포종에서 RNA-seq 데이터를 확보했다. 수백 개의 개별 종양 세포의 특성 분석을 통해 RAS/GEF GTP 의존 신호 전달 경로에 관여하는 3개의 돌연변이 유전자를 단일 세포 수준에서 확인하였다. 확인된 분자 경로는 3,000명 이상의 환자의 RNA-seq 데이터에 대한 메타 분석을 통해 확인하였다. 이러한 연구 결과는 단일 세포 수준에서 분자적인 분석을 통해 신경 교모세포종의 재발과 관련된 종양 아형의 진화적 특성을 보여준다 [9].

한편 H3K27M 돌연변이를 가진 신경 교모세포종은 주로 어린이의 중추 신경계 중간부에서 발생하며 종양 형성이 유전학과 세포 특성이 서로 협력하여 작용하는 것으로 알려져 있다. H3K27M 신경 교모세포종의 유전학은 비교적 잘 규명되어 있으나, 단일 세포의 세부적인 구조적 특성은 아직 잘 알려지지 않았다. Filbin 연구진은 6개의 원발성 H3K27M 신경 교모세포종에서 비롯한 3,321개의 세포에서 scRNA-seq을 수행했으며 이를 통해 H3K27M 신경 교모세포종이 oligodendrocyte 전구체 세포와 유사한 세포를 주로 포함하는 반면 더 분화된 악성 세포는 소수인 것을 규명하였다. 이들 연구는 H3K27M 신경 교모세포종의 단일 세포 수준에서 유전적인 하위 클론의 종양 발생 및 진행 프로그램을 가지고 있다는 것을 보여주면서, 신경 교모세종의 잠재적인 치료 표적을 제시하였다 [10].

2.5 scRNA-seq 데이터베이스

현재까지 구축된 scRNA-seq 데이터베이스를 살펴보면 다음과 같다.

ㆍscRNASeqDB (https://bioinfo.uth.edu/scrnaseqdb/)

Single cell RNA-seq은 텍사스보건대학 센터(The University of Texas Health Science Center, Houston)가 구축한 데이터베이스이며, 전사체를 탐색하기 위한 방법으로 생물학과 의학에서 유용하게 사용되고 있으며, 174개의 세포군에서 8,910개의 세포의 유전자 발현과 정보를 제공하는 scRNASeqDB 데이터베이스로 36가지 인체 단일세포의 유전체 발현을 검색할 수 있다 (그림 6). 특히 다양한 상태의 세포의 유전자 발현 정보와 heatmap, boxplot, gene correlation matrix, GO (gene ontology)와 pathway annotation을 제공한다.

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그림 6. scRNASeqDB 개요.



본 DB에서는 유전자 혹은 세포 유형별 검색이 가능하다. 예를 들어 IDH2 유전자의 경우 다양한 세포 유형에서 scRNA-seq 결과를 볼 수 있다. 한 예로 IDH2는 GSE67835 dataset의 경우 cortex, hippocampus 등 다양한 brain 부위를 구성하는 단일 세포에서의 발현을 살펴볼 수 있다 (그림 7).

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그림 7. 유전자 IDH2 검색 결과 예시.
[https://bioinfo.uth.edu/scrnaseqdb/index.php?r=site/geneView&id=IDH2&set=GSE67835]



또 한 예로 교모세포종을 구성하는 단이 세포의 발현을 검토할 수도 있다 (그림 8).

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그림 8. 신경 교모세포종 검색 결과 예시.
[https://bioinfo.uth.edu/scrnaseqdb/index.php?r=site/cellView&cell=glioblastoma_%5BCla%5D&set=GSE57872]



ㆍBrain scRNA-seq database (https://portals.broadinstitute.org/single_cell)

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그림 9. 브로드 연구소에서 제공하는 Brain 관련 단일 세포 RNA-seq 데이터베이스.



scRNA-seq은 장기 내 세포의 게놈, 전사체 및 후성 유전을 이해하는 데 획기적인 변화를 가져오고 있다. 예를 들면, 포유 동물의 뇌는 고도로 전문화된 기능 밎 지원 기능을 갖춘 수백만에서 수십억 개의 다양한 세포로 구성된 복잡한 네트워크로 이루어진다. scRNA-seq를 사용하면 뇌 세포의 이질성을 포괄적으로 분석하고 특정 기능과 상태를 밝힐 수 있다. 최근 마우스 뇌조직의 scRNA-seq에 대한 데이터베이스가 공개되어 제공되고 있다 (그림 9). scRNA-seq는 연구자들이 기능적 차이를 다루는 것뿐만 아니라 많은 뇌 영역 내의 다양한 세포 하위 집단을 식별하고 유전자 표지와 새로운 세포 마커를 정확히 찾아 낼 수 있다는 장점이 있다. 뇌가 가지는 다양성으로 인해 향후 이에 대해 많은 연구가 이루어질 필요가 있으며, 특정 뇌 세포 유형 및 기능을 규명하는 것은 발생, 건강 및 질병에서 뇌 기능 전체를 이해하는 데 중요할 것으로 생각한다 [11].

한 예로, 성체 마우스 해마 조직을 구성하는 단일 세포를 분석한 경우이다 (그림 10).

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그림 10. 성체 마우스 해마 조직을 구성하는 세포의 RNA 분석 예시.
[https://portals.broadinstitute.org/single_cell/study/-single-nucleus-rna-seq-of-cell-diversity-in-the-adult-mouse-hippocampus-snuc-seq]



또 다른 예로, 교모 세포종 연구를 검색한 경우는 다음과 같다 (그림 11).

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그림 11. 교모세포종 연구 검색의 예시 [12].
[https://portals.broadinstitute.org/single_cell?utf8=%E2%9C%93&search_terms=glioblastoma&order=&commit=]



3. 결론

단일 세포 수준에서의 분석은 종양의 이질성을 규명하고 각각의 아형을 분류하여 이를 위한 치료 전략을 마련하는 데 유용하나 [13], 이러한 접근법이 임상적으로 보편화 되기 위해서는 분석비용이 저렴해질 필요가 있으며, 분석법 및 데이터 처리 등에서도 향상되어야 할 것으로 사료된다. 단일 세포 수준에서의 RNA 뿐 만 아니라 WGS, WES, epigenetics [14] 등에도 적용하여 통합적인 정보를 확보할 필요가 있으며, 또한 관련 데이터베이스 구축이 중요할 것으로 사료된다.

2016년 10월 미국 매사추세츠 공과대학 브로드 연구소, 하버드대, 영국 케임브리지대, 생어연구소, 웰컴트러스트 재단이 인체 기관과 조직을 구성하는 35조개의 세포 기능과 특성을 해석하는 인간세포지도(Human Cell Atlas, 그림 12) 프로젝트를 시작한 바 있다. 여기에 더해 최근 9월 미국 국립보건원은 35조로 구성된 인체의 모든 세포를 지도로 구축하기 위한 인간 바이오분자 지도 프로그램(Human BioMolecular Atlas Program, HuBMAP)을 통해 지도책을 작성하고자 하는 연구 투자계획을 발표한 바 있다 [15]. 이는 단일 세포 분석 기술에 따라 많은 수의 세포를 개별 세포 수준에서 분석할 수 있게 되었기에 가능한 것이다. 이러한 대규모 프로젝트를 통해 가까운 미래에 인체의 조직 내 모든 세포의 구성 및 발생에 따른 변화와 조직, 세포 간의 상호 관계를 폭넓게 이해할 수 있을 뿐만 아니라 관련 질병과 적절한 치료 전략을 수립하기 위한 통찰의 문을 열 것으로 생각한다.

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그림 12. Human Cell Atlas [출처: https://www.humancellatlas.org/]



4. 참고문헌

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임창임(2018). 뇌종양에서의 단일 세포 RNA 시퀀싱을 이용한 전사체 연구동향. BRIC View 2018-T37. Available from http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3105 (Nov 15, 2018)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
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