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바이오통신원   
변화무쌍 스위치 단백질 관찰하는 바이오센서 개발
생명과학 기초과학연구원(IBS) (2019-01-15 10:41)

암세포의 이동과 신경세포 활성화 등 다양한 세포 기능에 관여하는 신호전달 스위치 단백질의 변화무쌍한 과정을 실시간으로 볼 수 있는 길이 열렸다. 기초과학연구원(IBS) 인지 및 사회성 연구단(단장 신희섭, 이창준) 허원도 교수 연구팀(KAIST 생명과학과)이 신호전달 스위치단백질의 활성을 모니터링하는 새로운‘바이오센서’를 개발하고, 살아있는 생쥐의 신경세포 활성화를 관찰하는데 성공했다.

세포의 신호전달 스위치 단백질은 스위치가 켜지면 기계가 작동하듯 활성화 여부로 세포의 기능을 제어한다. 대표적인 신호전달 스위치단백질인 small GTPase은 세포의 이동, 분열, 사멸과 유전자 발현 등에 관여한다. 핵심 단백질인 small GTPase를 제어할 수 있다면 세포의 기능도 조절할 수 있어 많은 연구팀들이 연구주제로 삼고 있다.

허원도 교수 연구팀이 그간 연구 노하우를 바탕으로 개발한 새로운 바이오센서는  small GTPase 활성의 모든 변화 과정을 실시간으로 볼 수 있는 도구다. 광유전학과 결합해 다양한 방식으로 관찰이 가능하고 민감도가 커 생체 내 두꺼운 조직 안에서 벌어지는 수 나노미터(nm) 크기의 변화까지도 정밀하게 볼 수 있다는 게 특징이다. 고감도 성능을 이용하면 살아있는 동물의 암세포 전이 및 뇌 속 신경세포의 구조변화를 관찰할 수 있어 향후 강력한 이미징 기술이 될 것으로 기대된다.

일반적으로 small GTPase의 활성을 관찰하는 데엔 형광 공명 에너지전달(FRET) 방식을 이용했다. 하지만 FRET 방식은 광유전학과 광 파장이 겹쳐 정작 관찰해야 할 세포신호의 변화는 보기가 어려웠다. 또 민감도가 낮아 동물 모델에 적용하는 것도 제한적이었다.

연구팀은 단백질 공학 기술로 5가지 종류의 small GTPase 단백질의 바이오센서를 개발하고 두 가지 파장(488nm, 561nm)에서 관찰이 가능한 바이오센서를 개발, 이를 동시에 분석하는데 성공했다. 연구진이 개발한 바이오센서는 기존 바이오센서가 청색광을 활용하는 광유전학 기법의 파장과 겹치는 문제를 효과적으로 극복해 세포의 이동방향을 살피면서 동시에 공간적 기능도 분석할 수 있는 장점이 있다.

연구팀은 유방암 전이 암세포에 바이오센서를 발현시키고, 광유전학 기술로 암세포 이동 방향을 조절하자 small GTPase 단백질이 활성화됨을 확인했다. 이 과정에서 암세포의 이동 방향이 변할 때, 세포 내 small GTPase가 이리저리 움직이며 활성화하는 모습을 실시간 이미징하는데 성공했다. 연구진은 small GTPase의 활성을 실시간으로 탐지해 추후 암치료물질을 탐색하는 등 다방면의 기술 접목이 가능할 것으로 전망한다.

더 나아가 IBS 연구진은 미국 막스 플랑크 플로리다 연구소(Max Plank Florida Institute)의 권형배 박사 연구팀과 공동연구를 진행했다. 연구진은 공 위를 달리는 실험으로 깨어있는 생쥐인 실험군과 마취된 대조군의 뇌 영역의 운동 피질의 신경세포에서의 small GTPase단백질의 활성을 비교하는데 성공했다. 살아있는 쥐에서 수 나노미터 단위의 신경세포 수상돌기 가시에서 실시간으로 변화하는 small GTPase 단백질의 활성을 관찰한 것은 이번이 처음이다.

이번에 개발된 바이오센서는 시냅스처럼 수 마이크로미터 단위의 미세한 구조에서도 목표한 단백질을 관찰할 수 있을 만큼 민감도가 크다. 실험쥐의 운동행동과 같은 생리학적 현상에 지장을 주지 않는 자연스러운 상태에서 뇌 영역을 바로 실시간으로 관찰할 수 있어 뇌 관련 연구에도 다양하게 적용될 수 있다.

연구를 이끈 허원도 교수는 “이번 연구는 small GTPase 단백질을 생체 내에서 관찰하기 위한 기존의 바이오센서들의 기술적 한계를 극복하는데 성공했다”며 “특히 청색 빛을 활용한 광유전학 기술과 동시에 적용할 수 있어 다양한 세포막 수용체와 관련된 광범위한 세포신호전달연구와 뇌인지과학연구에 접목이 가능할 것으로 기대된다”고 말했다.
연구결과는 세계적 학술지인 네이처 커뮤니케이션즈(Nature Communications, IF 12.353)에 1월 14일 오후 7시(한국시간) 온라인에 게재되었다.

논문명/저널명
Intensiometric biosensors visualize the activity of multiple small GTPases in vivo / Nature Communications

저자정보
Jihoon Kim, Sangkyu Lee, Kanghoon Jung, Won Chan Oh, Nury Kim, Seungkyu Son, YoungJu Jo, Hyung-Bae Kwon & Won Do Heo

연구내용 보충설명

■ Small GTPase 단백질의 활성 분석에 이용되는 기존의 바이오센서는 두 가지 형광단백질간의 형광 세기변화의 비율을 측정하는 형광공명 에너지 전달)FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) 기술에 한정되었다. 따라서 FRET 기술 고유의 제한성에 따라 다양한 실험에 접목이 어려웠다. 특히, 청색광을 이용한 광유전학과 광 파장이 겹쳐 시공간적 제어와 분석이 동시에 구현될 수 없었다. 또 낮은 감도와 성능으로 동물모델에 적용하여 실시간으로 활성을 관찰하는데 제한적이었다. 
■ 뇌 영역 중 운동피질(motor cortex)은 실험쥐의 거동에 따른 자극 인지와 신경세포 활성과 관련되어있다. 미국 막스플랑크 플로리다 연구소의 권형배 박사 연구팀과의 국제 공동연구를 통해 운동피질 영역의 small GTPase 단백질 활성을 최초로 실험쥐의 행동실험과 관련지어 해석했다.


연구 이야기
[연구 배경]
세포의 움직임, 역동적인 형태 변화는 small GTPase 단백질의 다양한 기능 중 하나로 보고되고 있다. 하지만 세포 내에서 small GTPase 단백질이 이동하고 움직일 때, 구획화된 기능을 갖고 있어 생화학적 분석으로 해석하는데 한계가 있다. FRET을 활용하는 바이오센서들이 제시되었으나 살아있는 생체 내 성능과 범용성이 매우 낮았다. 이에 기술적 한계를 극복 할 수 있는 신개념의 바이오센서를 개발하였다.
[어려웠던 점] 새로운 형태의 바이오센서를 제작할 때 가장 어려웠던 점은 검증이었다. 이미 널리 보급된 FRET 타입의 바이오센서와 동일한 조건으로 다방면의 비교・분석을 하고 서로 다른 개념의 두 바이오센서가 갖는 차이를 설명하는데 오랜 시간이 걸렸다. 또한 생물학 실험 시 적절한 응용성을 갖으면서도 기술적 한계를 극복했음을 보여주는 실험을 설계하고 찾는데 고심했다. 하지만 시행착오와 다양한 검증 실험으로 결국 기존의 바이오센서보다 월등히 나은 기술력임을 입증할 수 있었다.
 

[연구 과정] 이번 연구는 허원도 교수팀이 시작한 연구로 적합한 형광단백질과 바이오센서의 초기 디자인부터 단백질 공학을 통한 최적화 과정까지 제 1저자인 김지훈 연구원(KAIST), 공동 1저자인 이상규 연구위원이 기여했다. 이후 다양한 데이터 분석을 위해 김누리 연구위원이  통계 모델을 개발하고 고안했다. 이후 단일 수지상 돌기의 구조적 가소성 유도 실험 (structural plasticity of dendritic spine)과 살아있는 쥐의 뇌 운동피질영역 (motor cortex)에서 고해상도로 촬영하는 이미징은 미국 플로리다 막스플랑크 권형배 박사 연구팀이 맡았다.

[향후 연구계획] 허원도 교수 연구팀은 청색광수용 단백질을 이용한 광유전학 기술개발을 통해 세포의 다양한 현상과 관련된 신호전달체계에 대한 연구를 이어오고 있다. 유용한 기술과 효과적으로 접목 될 수 있는 바이오센서를 개발해 세포신호전달연구에 다양하게 접목 할 수 있다고 기대한다. 또한, 고감도 성능을 이용해 기존에 구현이 어려웠던 다양한 동물모델에서의 연구를 계획 할 수 있다.

실시간으로 관찰할 수 있는 small GTPase 바이오센서 개발

연구진이 개발한 small GTPase 단백질의 활성화를 보여주는 바이오센서(그림 a)는 기존의 청색광 유전학과 파장이 겹치지 않아 세포 또는 생체 내에서 시공간적으로 목표하는 단백질의 활성을 조절하고 관찰할 수 있다. 바이오센서를 세포 내 발현시키고 세포의 활성을 유도하자 그림(b)의 가운데처럼 small GTPase가 활성화됨을 실시간으로 관찰할 수 있었다.

small GTPase 바이오센서를 이용해 추적한 유방암 전이 암세포 관찰

연구진은 유방암 전이 암세포 MDA-MB-231에 Ras small GTPase 바이오센서를 발현시키고 세포 내 형태 변화를 관찰했다. 청색광 유전학 기술로 유방암 세포의 이동방향을 시공간적으로 조절하자 세포 이동 방향이 Ras samll GTPase 활성화에 따라 공간적 기능(암세포 내 붉은 부분) 과 관련이 있음을 확인했다. 연구진은 기존 바이오센서가 청색광 유전학과 파장이 겹치는 문제를 효과적으로 극복해 최초로 세포의 이동방향과 관련 단백질의 공간적 활성을 동시에 분석할 수 있게 되었다.

신경세포와 쥐 뇌 조직 내 마이크로 단위 단백질 관찰

 연구진은 청색광 유전학 기술로 세포 내 수용체 TrkB와 small GTPase 바이오센서(그림 a)의 활성화를 관찰했다. 바이오센서는 신경세포 내 다양한 수상돌기에서 수 마이크로 공간에서만 선택적으로 수용체와 Ras small GTPase 활성이 유도되는 것을 확인했다(그림b). 또한  신경세포의 미세한 수상돌기 가시(dendritic spine)내에서 Cdc42 와 Ras small GTPase 단백질의 활성을 빛으로 유도하고 시각화하는데도 성공했다(그림 c).

운동 행동 중인 쥐의 실시간으로 small GTPase 단백질 활성 분석

 위 왼쪽 그림처럼 쥐가 운동행동할 시 관련 된 뇌 영역인 운동피질에서 실시간으로 small GTPase 단백질의 활성을 관찰하는데 성공했다. 오른쪽 그림처럼 마취 상태와 깨어 있는 상태에서 나타나는 차별적 Ras small GTPase 단백질의 활성도가 다름이 나타났다. 이번 연구는 쥐 운동행동에 따른 운동피질 영역에서의 신경세포 활성과 관련된 Ras small GTPase 단백질의 활성을 수 나노미터 단위의 가지돌기 구조에서 분석하는데 첫 연구다.

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