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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western blot 1차항체 2차항체
초보자  |  2008.11.18 02:41
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
웨스턴 블롯에서
디텍션시 1차항체에 효소나 방사선동위원소를 이용해서
밴드를 볼수 있을텐데 왜 2차항체까지 사용하여 효소를붙여 확인하는건가요?
2차항체까지 처리하면 시간도 더 많이 들고 돈도 더 많이 들어가지 않나요?

확실하진 않은데 1차항체에 효소를 붙이는것이 2차항체에 붙이는 것보다
더 어렵다고 하다고 하는데....
(특정 단백질만을 검출하는 1차항체의 생산이 어렵다(?)
이런말도 있던데 무슨소리인지 모르겠네요 ㅜㅜ
#2차항체
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
님께서 말씀하신 방식인 direct 방식으로 detection을 한다면 specificity 측면에서 좋겠죠.
시간도 절약되고요.

하지만 돈과 시간이 문제 입니다.
1차 항체가 효소가 붙어 있는 것을 상업적으로 파는 곳이 있다면(ex:flag-hrp) 그것을 사용하면 간단히 해결됩니다(이럴경우 일반 flag보다 약간 더 비싸지만요).

반대로, 1차 항체에 효소가 붙어 있는 것이 없다!
이럴때 두가지를 생각해 볼 수 있습니다.
1. 직접 효소를 conjugation한다.
2. 상업적으로 파는 그냥 항체를 구입한후 2차 항체를 이용하는 indirect 방식으로 전환한다.

1번을 택했을 경우 봉착하는 문제는 조금 늘어납니다.
즉, conjugation 실험을 한번 더 하게되고, conjugation이 잘되었나 확인해야하며, conjugation에 의해 항체 활성등이 감소되지는 않을까 등등 확인해 보아야 할 상황이 많아지는 것이지요. 이때 비용적인 문제 또한 만만치 않을 것이고요.

그래서 대부분의 사람들은 1차 항체의 host를 이용해서 효소등이 미리 conjugation되어있는 2차항체를 구입해서 사용하는 것이지요.

이러한 원리는 western에만 국한되는 것이 아니라, ELISA등 효소 tagging을 이용한 항원-항체 반응 실험에 있어서 다 적용됩니다.

이해 되셨나요?? ^^
청개구리ryan  |  2008.11.18   
일단 답변감사드립니다^^;; 이해 되지 않는부분이 있는데
이차항체 반응에 있어서 일차항체와 이차항체가 어떻게
결합하는지에대해 알고 싶습니다.

2차항체는 1차항체에 비특이적으로 결합하나요?
아니면 1차항체에 특이적으로 결합하나요?
만약에 특이적으로 결합한다면 1차항체에대하여 별도로 2차항체를 제작하여야하나요?

1차항체에 효소를 붙이는것에 있어서 우리가 디텍션할 항원마다 항체가 달라지기 때문에 각 항체마다 효소를 붙이는것이 어렵고 돈이 많이 든다는 것인가요?

2차항체가 1차항체에 비특이적으로 결합한다면 (이렇게되있는건가요?) 1차항체에대한 2차항체를 별도로 제작하지 않아도 된다는건가요?
초보자  |  2008.11.18    
답변을 쓰고 있는데,, 날아가서 다시답니다ㅡ,.ㅡ;;

-> 1차 항체에 특이적으로 결합을 합니다. 예를 들어 p53단백질을 잡는다고 해봅시다.
님은 구입가능한 p53에대한 항체들을 찾아보겠지요. 선택한 것이 mouse에서 생성된 human p53 IgG라면 mouse anti-(human)p53 IgG라고 적을 수 있겠네요.
human p53의 항체를 human에서는 얻기 힘들기에(굳이 얻고자하면 얻을 수 있지만) 보다 쉬운 방법인 다른 동물에 human p53(peptide)을 injection한 뒤에 purification하여 얻습니다(일반적으로). 따라서 human p53이긴 하지만 생성된 곳은 다른 동물이 되는 것이고요.
2차 항체는 바로 이 동물을 인지하도록 만든 항체입니다.
따라서 2차 항체는 1차 항체의 host에 특이적으로 결합을 하죠.
2차 항체의 경우, 무궁무진한 단백질마다 다른 1차 항체와는 달리 host만을 인지함으로 몇가지(기껏해봐야 우리가 실험적으로 쓰는 동물들, 혹은 사람) 안됩니다. 따라서 회사들은 이것들에 효소등 여러가지를 붙여 놓은 것들을 팔고 있습니다(HRP conjugated goat anti-mouse IgG).
2차 항체를 사용자가 제작해야 한다면 굳이 indirect방식으로 하지 않고 direct방식으로 하겠지요.
청개구리ryan  |  2008.11.18   
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