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 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
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질문 adenovirus plaque assay
알bbc(과기인)  |  07.12 17:16

 

adenovirus를 제작하고 plaque assay를 진행할려고 합니다.

plaque assay protocol 에선 염색해서 plaque 확인까지만 있더라구요

염색된 plaque를 따서 바이러스 증폭시켜서 그 바이러스를 사용가능한가요? 

그게 불가능하다면 염색을 안하고 plaque를 현미경으로 확인한 뒤 

그것을 증폭할 수 있을까요??

증폭할려면 플라그를 멸균된 팁같은걸로 따서 세포 감염을 시키는건지..

실험 방법을 아신다면 설명 좀 부탁드립니다.

titer를 높이는 방법을 알고자 합니다. 

부탁드립니다. 

 

 t

#adenovirus
 
#plaque assay
 
#virus amplification
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

plaque assay를 하려고 하시는걸 보니 만들어진 adenovirus의 titer를 측정하고자 하시는 것으로 보입니다.

1. adenovirus의 titer를 측정하는 것은 대략 수일 정도가 소요되기 때문에 titer를 측정하는 과정 동안에, 이미 만들어져있는 virus의 titer가 떨어진다는 점을 감안하셔야 합니다. 즉, 지금 현재 있는 virus의 titer와 측정된 titer의 수치는 차이가 있을 수 있다는 것이지요. 본론으로 들어가자면, 염색된 plaque를 따서 그 virus를 증폭시키는 것은 의미가 없습니다. virus를 따서 증폭을 시킨다고 해봐야 어차피 titer는 또 달라질테니까요. 정 titer를 측정하고 싶으시고, 그 titer로 실험을 하고 싶으시다면 scale up을 아예 100ml 정도로 하셔서 titer 측정용 외에는 모두 deep freezing하여 보관된 virus의 titer를 유지하는 방법이 있긴 합니다.

2. titer를 높이는 방법 : 이것은 저도 수십, 수백 차례 수행을 해왔기에 경험적인 사실과 더불어서 말씀드리겠습니다. virus의 titer를 높이는 방법은, 즉 virus amplification은 293A와 같은 cell에 virus를 소량 처리하여 같은 바이러스를 만들게끔 하여 titer를 높이는 것입니다. 보통 virus를 O/N으로 처리하여, 만 24시간 정도에 절반 이상의 cell이 뜨게 되면 titer는 나쁜 편은 아닙니다. 하지만 거기서 더 titer를 높이시고 싶으시다면, 만들어진 virus를 293A에 더 높은 볼륨으로 처리를 하는방법도 있구요, freezing thawing을 하실 때 vortexing을 더욱 harsh하게 해주는 방법도 있습니다. 이런 tip들은 고민을 해보시어 더 편한 방법을 찾으시는 것을 추천드립니다.

Derek  |  07.13 15:43   

답변 감사드립니다.!

adenovirus를 제작해 둔것이 있지만 RCA같은 문제들때문에

cell line을 변경하여 재실험을 진행하고자 합니다.

plaque assay를 진행하는 수일동안 titer 변경되는 것은 알고 있습니다. 

그런데,, adenovirus의 PFU(or IFU)를 확인해도 VP를 차이가 나는것으로 확인되어

혹시나 plaque 를 따서 증폭을 할 시 vp or pfu가 증가하지 않을까해서 문의드렸던 것입니다.

그래도 답변해주신 것을 통해 증폭할 수있는 방법은 cell에 virus를 소량 및 대량으로 첨가해 높이는 수 밖에 없다는 것 또한 다시 한번 상기시켜주셨습니다. 

현재 TITER는 10^7~8인데 교수님께서 10^14 이상을 원하셔서... 올릴 수 있는 방법을 찾고 있습니다....ㅜㅜ

bbc  |  07.15 21:31   
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