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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문 cell lysis하고 harvest할 때 질문입니다
뒷다리뷰냐(과기인)  |  07.12 14:18

protein 뽑기 위해서 sample에 lysis buffer를 뿌리고 ice 위에서 scraper로 긁어서 회수하고 있는데요,

아무래도 scraper에 소량 국물이 남는 것이 찝찝해서요

물론 그게 몇퍼센트 되지도 않으니 큰 상관은 없는 것은 알고 있지만 그냥 기분이 찝찝하네요

어쨌든 scraper에 국물을 남기지 않거나 좀더 깔끔하게 셀을 긁어낼 수 있는 방법이 없을까 하여 질문드립니다.

#scraper
 
#cell harvest
 
#protein
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

긁을때 스크랩퍼를 사용하지 마시고 블루팁으로 긁어도 잘되고 기울여서 모으면 모을수도 있습니다. 스크랩퍼보다는 면적이 작으니 로스도 적은데...

어떤 웰을 사용하는지는 모르겠지만 몇방울까지 회수해야 한다면 웰 크기를 늘려 실험하시는게 어떨까요?

금개구리안재진  |  07.12 15:02  

cell lysis 하기 전에 cell을 trypsin으로 떼어내 tube로 옮기고 lysis 시키면

protein 회수 수율이 좋습니다.

대왕개구리SPEED  |  07.12 15:08  
Speed님 // 그러면 trypsin 처리후 centrifuge하고, pellet을 lysis buffer에 풀어 주는 느낌일까요? -20도에 들어가 있던 dish에도 적용할 수 있을까요?
뒷다리뷰냐  |  07.12 15:27  

mammalian cell을 그냥 냉동시키면 cell membrane이 random하게 damage를

받아서 일부 물리적 lysis가 된 상태입니다.

이런경우 cell을 trypsin으로 뗄수는 없고 바로 lysis시키는 것이 좋으며,

lysis buffer를 넣고 scraper를 사용하지 말고 1ml micropipette으로 시료를

처리하면 loss를 최소화 할수 있습니다.

따라서 cell을 실험에 사용하려면 dish에서 cell을 회수해 PBS로 washing 후

micro tube나 cornical tube에 넣어 냉동보관하는 것이 좋습니다.

대왕개구리SPEED  |  07.12 15:53  
두 분 모두 자세한 답변 감사드립니다! 많은 도움이 되었습니다
뒷다리뷰냐  |  07.12 18:13  

실험 방법을 결정하는 것은 실험 목적이다.

따라서 실험 방법은 실험 목적에 부합하는 것을 선택하여야 한다.

예를 들어, Cell lysis를 하는 목적이 시간대별로 처리한 샘플에서 인산화 정도를 보는 것이라면, 정해진 시간에 단백질분해효소 저해제와 탈인산화효소 저해제가 포함된 lysis buffer를 재빨리 섞어 주어 세포 내에서 일어나는 인산화 반응을 정지시킴과 동시에 단백질 분해와 탈인산화를 저해하여야 그 시간대에 일어난 현상을 정확하게 관찰할 수 있다.

이러한 경우, Trypsin을 처리하여 회수 후 lysis하는 방법은 맞지 않다. 그 사이에 여러 가지 반응들이 일어나 그 시간대에 일어나는 현상을 정확히 볼 수 없기 때문이다. 또 세포의 membrane 단백질을 확인하고자 하는 경우도, Trypsin에 의해 분해될 수 있기 때문에 적합하지 않을 수 있다.

염려하는 것이 단순히 샘플의 양적인 손실인지, 완전히 균질화되지 않은 상태에서 일부에 대한 질적 손실인지를 먼저 고려해야 한다.

양적 손실이 문제라면, lysis buffer를 나누어 일부는 1차 lysis용으로 하여 회수하고, 일부는 2차 wash용으로 하여 회수하면, 2차 wash 단계에서는 단백질 양이 현저히 적어 일부 scraper에 의한 손실이 발생하더라도 실제 단백질 손실은 크지 않다.

질적 손실이 문제라면, lysis 단계에서 pipetting으로 최대한 균질하게 lysis시킨 후 회수하되, scraper를 기울여 남아 있는 lysis buffer도 pipet으로 최대한 회수하면 손실을 최소화할 수 있다.

앞서 언급한 시간대별 인산화 양상을 비교하는 실험의 경우, 처리시간을 동시간대에 시작하고 각 시간대별로 회수하는 방법보다는, 처리 시간을 순차적으로 시작하고 동시간대에 lysis buffer를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 회수하는 방법이 끝나는 반응시간을 정확하게 조절하는 것이 쉽다.

앞다리DTer  |  07.15 13:40  
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