실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
western blot시 pAkt band가 나오지 않아 protocol 확인 부탁드립니다!
레벨1 Ere00 (대학원생)
안녕하세요! 고수님들 제가 western blot 진행을 하는데 total akt는 band가 나왔는데 pAkt는 band가 나오질 않아서 제가 실험하는 과정중에 문제가 있는지 확인 부탁드립니다!
-80℃에서 4~5년 보관된 mouse liver tissue를 35~45㎎ 사용하였고요
intron사의 pro-prep 5ml에 roche사의 phos-stop 1table을 녹여서 5ml tube에 600㎕을 넣고 ice에 끼운상태로 homogenizer를 사용하였고요
ice에서 20min간 cell lysis를 유도하고 centrifuge 13,000RPM으로 15min 돌린 뒤 상층액만 새로운 tube에 넣고 -80℃에서 보관하였습니다.
gel은 10% separting, 4% stacking으로 단백질 농도는 50㎍으로 loading했습니다
transfer는 PVDF membrane을 100% methanol에 적시고 transfer buffer에 한번 담그고 공기방울 최대한 없앤 뒤 100V에서 2hr 30min을 하였고요
transfer후에 100% methanol에 다시 한번 적시고 blocking하였습니다
blocking은 TBS에 5% skim milk을 사용하여 R/T에서 1hr 반응한 뒤 바로 1차 antibody를 붙였습니다.
1차 antibody는 cell signaling사 pAkt를 사용하였고 1:1000으로 TBS(pH7.6)에 5% skim milk를 o/n, 4℃에서 반응하였습니다.
TBS-T로 15min간 3회 washing을 하고 santa cruz사의 2차 antibody를 1:2000으로 TBS에 5% skim milk을 사용하였습니다.
또 TBS-T로 10min간 3회 washing하고 TBS-T가 있는 상태로 암실에서
Health care사의 ECL kit을 1:1 비율로 mix후 1min간 반응하고 cassette에 뿌린뒤 1min간 반응후 X-rat film으로 감광하였습니다.
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