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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 small intestine을 western blot으로 분석중인데 믿어도 되는 결과인지 모르겠습니다
알koken(대학원생)  |  05.16 12:12

Western 을 막 시작한 대학원생입니다

저는 현재 Small intestine을 western blot으로 분석하고 있습니다. BCA assay로 정량을 하고 western blot을 했을 때, beta-actin이 일정하게 나오지 않았습니다.

그래서 intestine은 다양한 cell들이 있어서 internal control을 맞추는 것이 어렵다하여서, 가장 잘 나온 beta-actin을 기준으로 잡고 loading sample을 다시 만들 때, sample의 양을 변화시켜서 조정하였습니다.

그랬더니 beta-actin이 잘 맞춰진 아래와 같은 결과가 나왔습니다.

upload_image

하지만, 코마시 블루로 젤을 염색했을 때 total protein의 양이 다른데, 이 결과를 사용해도 되는걸까요?? beta-actin이 계속 상이하게 나와서 여러번 실험을 반복하였는데, housekeeping gene이 맞춰지니까 total protein이 다르네요.. 사용해도 되는건지 모르겠습니다

 

#western blot
 
#intestine
 
#housekeeping gene
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

1. housekeeping gene이라고는 하지만, 정말 간.혹. 가다가 GAPDH나 Actin도 흔들리는 상황이 있긴 합니다. 그러한 패턴이 지속적으로 나타난다면 internal control으로 사용할 만한 다른 마커를 찾아보심이 좋을 듯 합니다.

 

2. 쿠마시 스테이닝으로 보신다고 하셨는데, 비슷한 방법으로는 폰슈 솔루션으로 gel 말고, membrane을 staining 해보는 것입니다. 이 폰슈라는 것은 구조 단백질을 염색을 하기에 전반적인 protein 로딩양이 정말 같다면 스테이닝을 했을 때 양적으로 비슷해 보일 겁니다. 

  그래서 폰슈로 스테이닝 했을때 비슷했는데, actin을 찍어보니 양이 다르면 actin도 흔들린다는 말이고 다른 마커로 보셔야할 것으로 판단됩니다.

p.s 쿠마시로 염색했을때 프로틴 양이 다르면 애시당초에 로딩 양 자체가 다르기 때문에 정확한 비교를 하기가 어렵다고 생각됩니다. densitometry를 한다고 해도 신빙성이 좀 떨어지지 않을까.. 생각됩니다..

나부랭이  |  05.16 17:57   
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