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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 cDNA Long distance PCR 전기영동시
알졸업좀..(대학원생)  |  05.13 12:00
첨부파일 파일첨부: 20190513133509.jpg (145 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요

요즘 식물바이러스에 대해 실험 중인데 바이러스 전체 지놈을 PCR하여 클로닝 하려고 합니다. 사용하는 바이러스는 (+) ssRNA이구요.. 7.5kb입니다..

먼저 식물로부터 total RNA를 얻고 RT후 PCR 하는 2step으로 진행 중인데 RT후 cDNA를 가지고 700bp정도의 specific primer를 가지고 PCR하면 밴드가 잘 떠서 RT는 성공한 것으로 보이는데 이제 이 cDNA를 가지고 Full genome PCR를 돌리면 첨부한 사진과 같이 전기영동시 밴드가 끌리거나 웰에 걸리네요..

왜 이런 현상이 나타나는 걸까요..? 해결방안이 있을까요?

#PCR
 
#전기영동
 
#Virus
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

Full length cDNA를 합성하고 전기영동 결과는 어떻게 나왔나요?

700bp 정도 확인한 걸로는 full genome 합성이 잘되었다고 보기는 힘들지

않을까 합니다.

primer 길이와 PCR 조건은 어떻게 되나요?

대왕개구리SPEED  |  05.13 16:35  

primer는 27mer이고 조건은 annealing 30s extension 10m으로 40cycle입니다

 

여러가지 시도를 해보는데 계속 같은 현상이네요..

 

알졸업좀..  |  05.13 19:34  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

cDNA 합성을 좀더 확인해 보는게 좋을 듯합니다.

1. 현재 template DNA양에서 10배 정도 줄여서 PCR해보세요.

2. 우선 PCR은 long PCR용 taq을 사용하는게 좋을 듯하구요 증폭은 8분정도,

cycs은 30정도로 확인해 보고 잘 나오면 40cycs로 늘여보는게 좋지

않을까합니다.

30cycs도 증폭이 잘되면 많은 양이 나옵니다.

3. 현재 primer에서 F와 3kb떨어진 곳에서 R을 합성해서 PCR해보고

R primer와 3kb 떨어진 곳에서 F를 합성해서 PCR 결과 2가지 모두 3Kb가

잘 나오면 full length cDNA가 잘 만들어 졌다고 볼 수 있을 것 같습니다.

대왕개구리SPEED  |  05.13 20:01  
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