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질문 Autophagy Western blot 조건
알butterfly525(대학원생)  |  04.15 22:29

안녕하세요!

저도 Autophagy를 공부하고 있는 대학원생입니다. 혹시 Western blot 조건 한번 알수 있을까요? LC3를 보려고 하는데 단백질이 잘 보이지 않습니다. 실험 할때마다 조건에 많은 영향을 받는거 같습니다.

혹시 membrane은 어떤걸 쓰고 있으신가요? (0.45um? or 0.2um?)

 그리고 혹시 전기연동 gel에서 내릴 때와 transfer 할때 쓰시는 연동조건 알 수있을까요? ( voltage, mA, time-연동시키는 시간)

gel은 몇 %로 만들어서 사용하시나요?

#Western blot
 
#Autophagy
 
#LC3
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

LC3라고 특별한 조건은 없고,
일반적으로 저분자 (< 30kDA ) 단백질을 Transfer할 때처럼 하면됩니다.

개인적 경험상 저분자 단백질의 경우 Semi-dry방식에다
보통 크기 (50~100kDa) 단백질을 볼 때 보다
Transfer 시간을 60~70%정도로 줄여주는 게 좋았는데요

제가 LC3 볼 경우에는, 
Semi-dry, 100mA, 35~40min에 (보통 크기 단백질의 경우 1시간)
membrane은 0.2um (PVDF) 사용하고있습니다.
(PVDF, nitrocellulose인지는 별로 안 중요하다고 봅니다.)
Gel은 15%~17%가 적당합니다.

Transfer 이후에 pre-stained protein marker쓰시면
저분자량 쪽의 band(10~20kDa) 들이 membrane으로 넘어갔는지 확인해보세요. 혹은 뒤에 종이로 넘어가지는 않았는지 체크해보세요.
band는 잘 넘어갔는데 안 보이는 경우면 ponceau s 염색해서10~20kDa 구간에 단백질들이 잘 Transfer되었는지 확인해보시면 되겠습니다. 단 PVDF membrane의 경우 애초에 ponceau s 염색이 잘 되지 않습니다.

뒷다리무광  |  04.16 01:22  
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