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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR 전기영동 후 Band 질문드립니다!
올챙이RBR(과기인)  |  04.13 19:34
첨부파일 파일첨부: ㅠ.jpg (47 KB)
이미지 첨부파일

식물 DNA 추출 후 PCR하고 Electrophoresis 완료 후 UV로 관찰하였는데요

그림처럼 Band가 나타납니다

gel 1% agarose에 0.5X TAE buffer 100ml당 10ul/ml인 Etbr 10ul 사용하였습니다.

buffer는 1X TAE buffer 사용하였습니다.

Dye가 Gel의 중간정도 올때까지 영동시켰습니다.

여기서 첫번째 궁금증은 dye가 내려온 부분까지 모든 gel이 형광을 띄는데 정상인가요? band가 나타났다고 해도 보이지 않을 정도입니다.. Etbr 농도는 protocol대로 사용했습니다..

두번째 궁금한 것은 Dye보다 band가 아랫부분에 있다는 것입니다. 물론 보이진 않아도 Dye와 wel 사이에 있을 수도 있지만 Dye가 제일 영동 속도가 빠른걸로 알고있습니다..

궁금합니다..

#PCR
 
#DNA extract
 
#Electrophoresis
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

8개 lane 모두 sample이 있나요?

그리고 gel에 EtBr을 넣는 경우 gel이 너무 밝게 나오는 겨웅도 있는데 이럴 경우

gel을 증류수에 30분 정도 담궈서 EtBr을 조금 제거하고 다시 확인해 보세요.

BPB보다 많이 내려가는 band도 있습니다.

그리고 marker는 없나요?

전기영동 buffer는 1X TAE는 열이 많이 나기 때문에 0.5X로 하는 게 좋습니다.

대왕개구리SPEED  |  04.13 19:49  
네 모든 wel에 loading했습니다! random primer를 사용해서 band가 나타나지 않을수도 있다고 들었습니다

Dna Marker는 모두 사용하여서 구매예정입니다..ㅠ

조언 감사합니다
올챙이RBR  |  04.13 19:53  

PCR 목적이 뭔지 잘모르겠지만 random primer로 PCR하면 dsDNA가 잘

안만들어 집니다.

 

대왕개구리SPEED  |  04.13 19:56  
식물 두종의 색발현에 관여하는 dna를 찾아보는 학부실습입니다

서열을 모르기때문에 어쩔수 없습니다..ㅠ
올챙이RBR  |  04.13 20:06  

random primer 특성상 F, R primer 역할을 정확히 할수가 없기 때문에

band가 안나오는게 정상일 겁니다.

대왕개구리SPEED  |  04.13 20:22  

Dye가 항상 제일 빨리 움직이는 것은 아닙니다. Gel의 농도에 따른 dye의 이동속도와 DNA fragment 또는 DNA product의 이동속도와의 관계에 대해서는 molecular cloning이라는 서적을 찾아보시면 잘 알 수 있습니다.

그리고 사진상에 젤이 붉게 나타나는 현상은 EtBr을 과량으로 넣었을 때 나타나는 일반적인 현상입니다. EtBr stock solution을 사용하다보면 시간이 지날수록 농도가 진해집니다. 이 경우 원래 제시된 양보다 적게 넣거나 3차 증류수에 젤을 담궈서 EtBr destaining을 하면 해결할 수 있습니다.

Random primer를 사용한 실험이라고 하셨는데 이 경우는 band가 다양하게 뜨거나 아예 안나올 수 있습니다. 또한 그것이 정확하게 원하는 target 유전자를 product인지도 알 수 없습니다. 아마 식물이라고 하면 색소를 결정하는 인자의 유전자의 일부에 대해서라도 consensus sequence가 밝혀져 있을 것 입니다. 그것을 이용해서 primer를 제작하는 것이 바람직할 것입니다. 또한 색소를 결정하는 protein sequence (다른 식물의 경우라도) 정보가 있다면 그것으로 DNA sequence를 역추척해서 primer를 design하는 것이 바람직할 것입니다.  

개구리식스센스  |  04.15 09:16  
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