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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 vector 질문입니다. 도와주세요... (restriction enzyme, cloning)
올챙이방탕소년(과기인)  |  03.12 15:52
첨부파일 파일첨부: 궁금해.png (112 KB)
이미지 첨부파일

upload_image

안녕하세요.

예전에 클로닝을 진행하고 이번에 그냥 확인용으로 전기영동 후에 이상한 점이 있어서 글 남깁니다.

사진이 조금 혼란스러울 수 있는데 vector B 위주로 설명드리겠습니다.

원래 4개의 enzyme을 사용해서 클로닝을 진행했습니다.

3번 lane을 보시면 이상하게 EcoRI과 XhoI을 사용했을 때, 가운데에 이상한 band(②????로 표시했습니다.) 가 같이 뜹니다. (참고로 아래에 뜬 band는 원래 떠야 하는 band가 맞습니다.)

혹시나 뭔가 문제가 있나 싶어서 각각 enzyme 처리를 했을 때에도 이상하게 그 위치에 band가 계속 뜹니다.

cutsmart buffer를 의심하기에는 2번 lane에서는 그런 band가 확인되지 않고 깨끗하게 two cut이 나는 걸 확인했습니다.

혹시 짐작가는 게 있으시다면 사소한 거라도 설명 부탁드리겠습니다.

도와주세요...부탁드립니다.

참고로 DH5a이고, PCI처리도 진행했습니다.

 

#cloning
 
#plasmid prep.
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[(주)필코리아테크놀로지] NEB사 DNA Seamless Assembly Cloning
NEBuilder HiFi DNA Assembly는 Single tube에서 최대 6개 fragments, 20 kb gene assembly를 15분 내 가능합니다. NEB Golden Gate Assembly는 제한효소 BsaI 및 T4 DNA ligase를 포함한 Assembly Mix, T7 / SP6 promoters 포함한 plasmid 제공합니다.
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

안잘린 vector에서도 나오는 걸 봐서는 CCC form입니다.

진하게 보이는 band가 relaxed ccc form이며 prep 상태가 그리 좋지는 않아 보입니다.

prep 상태가 좋으면 ccc form이 가장 많이 나와야 하며 2번 lane외 3, 4, 5번 lane은

완전히 cutting되지 않아 안잘린 band가 조금 남아있는 겁니다.

대왕개구리SPEED  |  03.12 16:00  

답변 감사드립니다.

다행히 cloning 실수는 아니었네요.

왜냐면 분명 sequencing confirm도 했던 애들인데

이상한 band가 떠서 엄청 놀랐거든요;;;

그리고 추가로 궁금한 게 있습니다...

저희는 보통 large scale로 prep.을 진행해서

최대한 깨끗하게 뽑으려고

PEG8000도 처리하고 PCIAA → CIAA 처리까지 하는데

prep 상태가 안 좋을 수 있을까요? 아니면 농도를 1ug

상태로 보관하고 있어서 그럴 수도 있을까요?

올챙이방탕소년  |  03.12 18:10  

prep 단계가 너무 많으면(PEG는 처리하지 않아도 됨) 상대적으로 ccc form이 풀릴

가능성이 높습니다.

plasmid 농도문제는 아닙니다.

대왕개구리SPEED  |  03.12 18:34  

조금 다른 의견을 드립니다.

uncut에 보이는 두꺼운 밴드가 ccc form 으로 보입니다.

그 밑에 희미한 밴드(번호로 표시한 거)는 denaturation 된 single stranded plasmid DNA라고 생각합니다.

ssDNA라서 제한효소에 잘 잘리지 않습니다. 간혹 EcoRI 같은 효소의 star activity라고 부르는 현상으로 잘리기는 하지만 보통은 안잘린채 남아있습니다.

클로닝을 그냥 진행해도 보통은 별 영향을 주지는 않습니다.

 

대왕개구리강시  |  03.12 18:38  

plasmid prep. 단계에서 ssDNA는 prep되지 않을 겁니다.

완전히 변성되었다면 gDNA와 같이 제거 되었을 거고 만약 제일 밑의 band가 ssDNA라면

lane2에서 잘리지 않을겁니다.

lane 2에서 자린것을 볼수있고 만약 ssDNA라면 dsDNA와 분자량이 2배 차이가 날겁니다.

안자른 plasmid끼리 비교라 하더라도 제일 아래 band가 위의 두꺼운 band의 절반분자량인데

제일 아래와 위 band의 분자량 차이가 그렇게 나지 않아보입니다.

대왕개구리SPEED  |  03.12 19:08  

SPEED님.

아가로스젤 상에서 길이가 같은 ssDNA와 dsDNA의 이동속도는 길이에 반비례하지 않습니다. 마치 circular DNA와 같은 길이의 linear DNA의 이동속도가 차이나는 것처럼요.

https://bitesizebio.com/13524/how-to-identify-supercoils-nicks-and-circles-in-plasmid-preps/

위 사이트에 가시면 그 이유가 설명되어 있습니다.

miniprep 하는 동안 왜 circular ssDNA가 나타나는지, 왜 linear plasmid가 생기는지를 설명해주고 있습니다.

대왕개구리강시  |  03.13 09:36  

아가로스젤 상에서 길이가 같은 ssDNA와 dsDNA의 이동속도는 길이에

반비례하지 않습니다.

마치 circular DNA와 같은 길이의 linear DNA의 이동속도가 차이나는

것처럼요.

: 당연히 비례적이지 않습니다.

그러나 어느정도 차이는 나고 질문의 첨부 사진에서 제일아래 band가

ssDNA라면 위 band 보다는 좀더 내려가야 한다는 뜻입니다.

-miniprep 하는 동안 왜 circular ssDNA가 나타나는지, 왜 linear plasmid가 생기는지를 설명해주고 있습니다.

: 이론적인 내용은 알고있지만 실제 발생하지 않는다는 것입니다.

ssDNA는 prep. 과정에서 gDNA + 변성 protein complex와 함께 침전되어

제거됩니다.

제한효소로 절대 안잘리는 ssDNA가 plasmid prep.에서 나온것을..

혹시 강시님은 직접 경험해 본적이있나요?

저는 오랜기간 prep.을 했지만 단 한번도 경험해 보지 못했습니다.

첨부 사진 2 번째 lane을 보면 제일 아래 band도 제한 효소로 잘 잘린것을

볼수 있습니다.

제일 아래 band가 ssDNA라면 2번 lane에서도 제한효소로 잘리지

않을겁니다.

대왕개구리SPEED  |  03.13 11:05  
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