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질문 Electroporation용 Competent cell 제작
알리노(과기인)  |  02.07 09:37

선배님들 안녕하십니까
현재 학부1학년을 마치고 실험실에 들어와 아는 것은 없지만 열심히 노력하고 있는 학생입니다.

교수님께서 18년도 2학기에 오신분이라 저와 같이 실험실 세팅을 해왔고, 거의 다 구축을 했는데 Elcetroporation만 애매한 상태입니다. 기계의 기본 설정값으로 여러 번 조건(healing or cuvette의 크기)를 바꿔보며, colony가 나오게 하는데 성공 했고, miniprep 후 Enzyme cut으로 전기영동까지 하여 제가 넣었던 Plasmid가 맞다는 것을 확인했습니다.

문제는 실험을 하며 날짜가 지날수록 그 다음 실험에서는 colony의 수가 적어진다는 것입니다. 제 생각으로는 Competent Cell에 문제가 있는 것 같은데 제 protocol이 맞는지 확인해주시면 감사하겠습니다.

E.coli Com.Cell - DH5a

1. LB Broth 50ml에 1%접종하여 7시간 성장 후, 50ml tube에 23ml씩 나눠담고 Centrifuge 3000rpm, 5min
2. 상층액 버리고 autoclave한 3차 증류수 30ml 넣은 후 Centrifuge 3000rpm, 5min으로 washing
3. 2번과정을 4번더 한다.
4. 상층액 버리고 각 tube에 3ml의 autoclave한 3차 증류수 넣고 살살 resuspension 후 2개의 tube를 합치고 e.p tube에 100ul씩 넣고 -80도에 보관


이렇게 만든 Com .Cell을 사용하는데요. 제가 생각한 것은 혹시나 각각 3ml의 autoclave한 3차 증류수를 넣어서 E.coli가 -80도에서 시간이 지나서 죽지는 않았나입니다.
Heat shock transformation용 Competent Cell을 만들때에는 15%glycerol을 넣었었는데, 이것도 Glycerol을 넣어야할까요?

#Competent Cell
 
#E.coli
 
#Electroporation
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. LB Broth 50ml에 1%접종하여 7시간 성장 후, 50ml tube에 23ml씩 나눠담고 Centrifuge

3000rpm, 5min

: OD값이 0.5 ~ 0.7 정도까지 배양하는 것이 좋습니다.

너무 많이 키우면 electroporation 효율이 낮아 집니다.

 
4. 상층액 버리고 각 tube에 3ml의 autoclave한 3차 증류수 넣고 살살 resuspension 후

2개의 tube를 합치고 e.p tube에 100ul씩 넣고 -80도에 보관

: -80도에 보관하려면 15% glycerol이 포함된 멸균수에 현탁해서 보관해야 합니다.

대왕개구리SPEED  |  02.07 13:59  

감사합니다!!
혹시나 했는데 역시 4번 과정이 잘못됐군요ㅠㅠ

알리노  |  02.07 15:14  
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