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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 웨스턴시 total protein normalization 을 하고 싶습니다.
뒷다리뷰냐(과기인)  |  02.06 22:34
세포에 UV를 treat하고 단백질을 보고 있습니다.
단백질은 원하는 패턴이 나오는데요, 문제는 houskeeping gene입니다.
UV를 줘서 비실비실하거나 많이 죽은 cell의 경우 b-actin 수치가 흔들립니다.
처음에는 정량 문제라고 생각했는데 actin도 패턴이 동일한걸 보면 actin 발현량 자체가 변화하는게 맞는 것 같습니다. 

이 문제를 해결하기 위한 방법을 찾고 있습니다.
물론 1차적으로는 GAPDH 등으로 control을 바꿔보려 합니다. 

그러나 결국 근본적인 문제해결이 아닌듯합니다.
논문을 찾아보니 housekeeping gene에 대해 linear하지 않다 얘기가 많습니다.
몇 journal에서는 total protein normalization하는 것을 추천한다고 하네요. houskeeping gene band intensity로 normalization하여 수치화한 데이터는 앞으로 받지 않겠다!는 곳도 봤습니다.

그래서 저도 total protein normalization을 해보려 합니다.
저는 transfer 후 blocking 전 ponceau S 염색하여 단백질을 확인하는데요,
(위에서 actin이 흔들린다는 경우도 ponceau 염색에서는 일정하게 잘 나왔습니다.)

우선 제가 생각한 것은 ponceau S 염색하고, D.W. 워싱해서 background를 하얗게 만들고 사진을 찍고, ImageJ를 이용하여 lane의 총 band를 확인하는 것입니다. 사진은...일단 핸드폰으로 찍어야 하지 않을까 싶어요
(구글링을 해 보니 좀더 감도가 좋은 염색약이라든가 gel 자체에 UV주면 발광하는 물질을 넣는 방식이라든가 다양한것같은데 현재 저희방에는 ponceau밖에 없어서요 ㅠㅠ ponceau보다는 다른걸 쓰라고 하긴 하네요)

제 생각대로 해도 될지요? 혹시 total protein으로 normalization하는분들 method가 있다면 공유 부탁드립니다. 

* 참고: http://www.jbc.org/content/290/50/29692.full
"To avoid potential pitfalls and with a focus on improving transparency, the JBC strongly recommends that authors describe their methods used to quantify signal intensity, how the linearity of signal intensity with antigen loading was established, and how protein loading was normalized between lanes. We prefer that signal intensities are normalized to total protein by staining membranes with Coomassie Blue, Ponceau S, or other protein stains, and we strongly caution against the use of housekeeping proteins for normalization, unless there is a clear demonstration that expression of the housekeeping protein is unaffected by the experimental treatments."



#western blot
 
#normalization
 
#housekeeping genes
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

단백질은 원하는 패턴이 나오는데요, 문제는 houskeeping gene입니다.

: housekeeping gene으로 normalization하지 않았는데 단백질이 원하는 패턴으로

나왔는지는 알수는 없습니다.

이런 실험은 죽은 세포를 최대한 washing 후에 실험하면 WB 결과가 잘나옵니다.

세포가 정상적으로 살아있는 경우  houskeeping gene의 의미가 있는 것이지

cell이 죽으면 cell이 가지고 있는 protease가 모든 단백질을 랜덤하게 분해하기 때문에

현재 나오는 단백질 패턴도 신뢰성이 별로 없을 것으로 보입니다.

가장 좋은 것은 죽은 세포를 잘 제거하고 실험하는 것입니다.

대왕개구리SPEED  |  02.07 14:05  

웨스턴말고 qPCR이나 luciferase assay 등을 이용하는 건 어떨까요?

개구리kakaoblack99  |  02.07 21:34  
우선은 여러개 다 하고 있습니다. 감사드립니다
뒷다리뷰냐  |  02.08 11:04  

UV 쳐도 잘나오니  손을 탓해야합니다.
셀수가 작아서 제대로 못맞춘거에요
정확하게 긁어서 단백질뽑고 제대로 하세요.ㅋ 

제리코  |  02.08 17:27   

아 물론 제 손이 아직 어설픈 것도 있겠지만
그리고 노력해서 housekeeping gene 일정하게 맞추면 기분 좋겠지만 그게 포인트는 아니었고요.


total 맞추는게 더 정확한 방법이라 하니 혹시 해보신분의 의견을 들어보고 싶었을 따름입니다.

뒷다리뷰냐  |  02.09 17:25  

액틴 일정한 밴드 띄워도 찝찝함이 가시지 않을 것 같아서
방에 있는 물질 장비 수준에서 total을 측정할 방법이 있을까 해서 도움을 구한 것이었는데 잘 전달이 안 된 모양이네요. ㅠ

뒷다리뷰냐  |  02.09 17:28  

total protein을 맞추는 것은 2차적인 문제인것 같습니다.

1차적으로 housekeeping gene으로 실험하는 것이고 이 자체가 normalization이 잘 되지

않으면 well에 loading된 단백질이 들쭉 날쭉 할것입니다.

housekeeping gene으로 실험 가능할 경우 total protein으로도 실험 가능한것이지

housekeeping gene으로 실험이 잘 안되기 떄문에 다른 기준으로 실험한다는 것 또한

어느정도 신뢰성있는 결과가 나올지는 조금 의문이 생깁니다.

그다지 어려운 실험이 아니기 때문에 housekeeping gene으로 normalization해서 실험하는

skill을 얻는것이 좋을 듯합니다.




대왕개구리SPEED  |  02.09 17:32  
웨스턴 자체가 total protein 양이 같을 때 타겟 protein 양을 보는 것이 목적이라고 알고 있습니다. 즉 상대적 발현량입니다.
"housekeeping gene 발현량은 항상 전체 protein 대비 일정하다"라는 가정하에,
total protein을 대변할 수 있는 지표로서 hkp를 사용하며, b-actin, a-tubulin, gapdh 등이 쓰인다고 알고 있습니다. 혹은 별일없으면 양이 일정한 신호전달물질 (AKT나 ACC 같은것들)로도 로딩이 정확히 들어갔는지 체크정도는 할수있다고 배웠고요.
그래서 결국 hkp의 사용은 total 양을 "간접적"으로 나타내는 것이고요

다만 이번에 스스로 공부를 하며 알게 된 것인데,
hkp gene 발현량이 항상 일정한 것이 아니며,
특히 액틴의 경우 세포 골격이 무너질 만큼 harsh한 컨디션에서는 차이가 날수도 있다
또한 빛을 발현시키는 시스템(ex. HRP)에서, actin의 band density가 실제 actin양에 linear하지 않다. 뿐만 아니라 양이 많거나 감광시간이 길어지면 saturation 문제때문에 actin 양을 normalization 지표로 사용하기에 문제가 생긴다

그런데 total protein으로 정량을 하는 경우 2차적인 지표인 HKP에 비해서 더 직접적이고, linear하다. 심지어 ponceau S를 그냥 사진찍어서 density 분석한 것 조차도 actin보다는 reliable하다. (Gilda, J. E., and Gomes, A. V. (2013) Stain-Free total protein staining is a superior loading control to beta-actin for Western blots. Anal Biochem 440, 186-188)

몇 년 사이에 이런 논의가 많아져서 JBC 등의 저널에서는 이제 액틴 밴드 이용해서 수치 구하지 마시오 지침이 생긴 것으로 알고 있고요

hkp에 의문을 표하는 논문은 많습니다 구글링해보면 많이 나오네요


------
하여튼 각설하고 그래서 여기 bric 사이트에 계신 분들도 (이러한 문제제기에 동의한다면) stain-free method나 staining 후 총 density 측정 등으로 해본 분들이 있는지 궁금했습니다.
그냥 제 손을 더 좋게 하려는 시도였으면 여기에 질문을 올리지도 않았죠 -_- 
(웨스턴할때 별일없이 약만 주거나 한 경우는 액틴 이쁘게 일정하게 잘 나옵니다.)

그래서 그런 의도로 질문을 올린 것이었습니다.





뒷다리뷰냐  |  02.09 20:23  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

어떤 의도를 가지고 질문을 올린건지는 충분히 알고 있습니다만..

현 실험에서 가장 중요한 죽은 cell이 포함되면 아무리 total protein을 정량하더라도

오차가 많이 발생한다는 것입니다.

이것만 발생하지 않으면 어떤 방법으로 normalization을 하더라도 정확한 결과가

나올겁니다.

가령 일정시간, 어떤 조건을 처리하여 배양한 100개의 cell에서 추출한 단백질은 언제

추출 하더라도 비슷한 양이 나올거고 거기에 포함된 housekeeping gene은 항상 어느

정도의 level을 유지합니다.

문제는 위와 같은 조건인데 90개의 건강한 cell에 10개의 죽은(죽어가는) cell이 포함된

경우는..

죽은(죽어가는) 10개의 cell에서 나오는 단백질이 그때그때 다른다는것에 문제가

발생합니다.

따라서 죽은(죽어가는) 10개의 cell에서 나오는 housekeeping gene 또한 당연히

일정하지 않은 양을 보이기 때문에 정확히 제거하는것이 필수적입니다.

그리고 죽은(죽어가는) 세포가 포함된 상태에서 total protein자체도 시료 군마다 달라지기

때문에 normalization하기에 문제가 발생합니다.

결과적으로 죽은 또는 죽어가는 cell을 정확히 제거해서 실험하면 어떤 방법으로

normalization해도 문제가 없습니다.


대왕개구리SPEED  |  02.09 21:05  

답변 정말 감사드립니다.


현재 저는 harvest할때 cold PBS로 수 회 washing하여 lysis 진행하고 있습니다.
또한 센 자극을 주는 실험에서는 배지를 갈아줄 때 washing을 신경써서 하고 있고요


죽은 cell을 더 효과적으로 진행하는 방법이 있을지 궁금합니다.


그리고 죽어가는 것에 대해서....
저는 한 80%는 죽어서 둥둥 뜨고 20퍼는 겨우 붙어 있는 경우는 그냥 샘플을 버리는 식으로 하고 있습니다.


다만 granule이 많은데 (건강하진 않은데) 어쨌든 전체적으로 세포가 붙어 있다 싶으면 진행하고 있고요.


더 효과적인 방법이 있을지요?

뒷다리뷰냐  |  02.09 22:27  
실험 조건을 optimization할 필요가 있는 것 같습니다.

UV 강도와 노출 시간 등을

세포가 많이 안죽어도 target protein에는 변화가 보이는 조건을 찾는 것이 어떨까요?

Drug treatment나 stress로 인해 배양 중인 세포에 고비율의 cell death가 발생하는 경우에는

까다롭긴하지만 시간 농도 강도

cell이 죽기 직전의 조건을 찾는 게 가장 중요합니다.

좋은 조건을 찾으면 당연히 재현성도 높아질 겁니다.




올챙이무광  |  02.10 03:32  

나름대로 조건을 한번 잡고 실험을 들어가긴 했는데


이게 실험 자체가 분화를 시키고 하는거라 셀이 기본적으로 짱짱하지는 않거든요
또, 분화 기간이 길다보니 샘플마다 편차가 생길 확률도 증가하는 것 같습니다.
예컨데 A라는 조건을 잡아놨는데, 어떤 경우는 죽고 어떤 경우는 살고 이럽니다.
A라는 조건에서 낮추면 단백질이 안 나오는 경우가 생겨 버리고요.


결국은 많이 해 보면서 더 감을 익혀야 할 것 같네요. 감사드립니다.

뒷다리뷰냐  |  02.10 13:04  

굳이 꼭 western으로 해야 되는 이유가 있으신가요?

 qPCR이나 luciferase assay를 이용하면 target gene expression / hk gene으로 normalization해서 값을 얻기 때문에 이와 같은 경우에 이용하시면 될 듯한데..

 저도 실험 경험이 많이는 없지만, 이러한 실험적 한계점 때문에 여러 검증된 실험 방법이 있는 거고, 필요에 따라 적절한 실험 방법을 선택해서 사용하는 것이라 생각합니다ㅎㅎ

개구리kakaoblack99  |  02.15 18:15  
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