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 전체 > Cell Biology > Viability
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질문 세포독성, MTT, 미지의 약물을 이용하여 세포효과를 보고자 합니다.
올챙이Jay ewha(대학원생)  |  01.12 22:23
안녕하세요. 박사 1년차 입니다.

엑소좀을 뽑아서 세포에서 효과를 보고자합니다.

그런데 제가 뽑은 엑소좀이 레퍼런스가 전혀없는 상태라서 어디에 어느 효능이 있는지 밝혀진게없습니다.

이런경우에 농도를 정해서 세포에서 처리한 후에 세포 독성을 보이는 농도 이하로 픽스하고 여러군의 세포에 픽스된 농도의 엑소좀을 처리 한 후에 평가 지표가 되는 마커들을 분석하고자합니다.

제가 궁금한것은 세포 독성을 보이는 농도 이하로 픽스할때에 쓰는 세포는 어떤것을 써야하는지, (제가 타겟으로 하는게 아직 정해진게 없으니 효과를 보일만한 셀 조차도 결정할수가 없는상태) 그러면 세포 분열에 효능을 보이는지 암세포 타겟하여 킬링 효과를 내는지 모르니까 농도를 잡을때부터 다양한 셀을 이용해서 전반적으로 독성이 보이지 않는 농도 이하로 결정해야할까요?

세포를 정해서엑소좀을 쳤다고 치고, 그럼 세포에서 mtt 로 apoptosis/neceosis만 보는게 아니라 그 세포가 독성때문에 죽은건지 약물의 효과로 죽은건지 확인을 위해 마커까지 확인하려 하는데,, 이게 맞을까요?

ㅠㅠ 선배님들 넓은 아량으로 알려주시면 제가 멀리서나마 모든일 잘되시라고 진심으로 응원하겠습니다. 새해복 많이 받으세요!
#엑소좀
 
#Mtt assay
 
#세포독성
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

일반적으로 MTT가 세포의 사멸 또는 생장을 대변한다고 하지만, 메타볼리즘 자체에 영향을 주는 상황이라든가 또는 우연치 않게 약물이 MTT를 환원시키는 경우 (Vit C+Vit A 동시처리) 에는 생각치도 못한 오답이 나오는 경우가 많습니다.. 아니면 MTT가 환원되지 못하는 상황이면서 동시에 세포사로는 안 갈 가능성도 있겠고요.

그래서 당연하게도 웨스턴 블롯이나 PI/A-V 등으로 추가 확인하셔야 되고, MTT가 오답을 줄 수 있기 때문에 MTT 와 그 유도체들 (WTS MTS etc)가 아닌 것들로도 세포의 사멸/생장을 측정하실 필요가 있습니다.. 세포 계수기가 있다면 트립판 블루 익스커젼 등도 답이 될 것이고, 크리스탈 바이올렛도 답이 될 것이고, 스피어 포밍 어세이 등도 있고.. 아예 LDH assay 처럼 멤브레인이 박살나고 안 나고 등으로 확인하는 것도 있고..

레퍼런스 없이 약물 쳐서 보시는 경우엔, 이미 답을 알고 있어도 조금은 조심하셔야 합니다..
보통 실험 Figure의 1 또는 a를 만만한 MTT로 시작하는데 실험 시작도 못하고 잘못된 방법으로 인해 엎지 않아도 될 실험을 엎어버리는 경우가 생길 수 있어서.

그렇지만 이 경우엔 엑소좀만 뽑아서 처리하는거니깐 그럴 가능성은 매우매우 낮으니..
적당히 IC50 농도를 처리 후 24시간 정도 또는 48-72시간에서 잡으시고, 다른 세포사 실험 1-2가지 정도 추가해서 보여주시면 될 거 같네요.. 세포가 죽지는 않고 느리게 자랄 가능성도 있으니 저라면 PI/A-V 와 웨스턴 블롯 정도를 할 거 같습니다.. 정말로 안 죽으면 아예 데이터를 MTT보다는 다른 어세이를 쓸 거 같고요.

...  |  01.13 16:41   
선배님, 친절한 답변 감사합니다. 선배님 하나만 더 여쭤봐도 될까요?

( MTT인 경우 ) 미지의 약물로 lung cancner 세포에 농도별로 쳐보았을때 일정농도 이상에서 세포가 50%가 죽었고 제가 세팅한 최고 농도에서 세포가 모두 죽었다고 할 때 이후 실험역시 최고 농도로 진행하는 것이 맞는건가요?

너무 기초적인 질문이라서 황당하실수도있는데 제가 확인한 논문에서는 IC50을 보이는 약물 농도를 확인 후 여러 expression markere들을 확인하였더라구요. 아니 왜?라는 의문이 생겼어요. IC50이상을 보이는 더 높은 농도로 처리하면 암세포가 확실히 죽을텐데. 혹시 정상세포에 영향을 미칠 수도 있다고 판단해서였을까요? 그렇다면 정상세포와 암세포에 함께 처리해서 IC50을 보이는 약물의 농도가 아닌 암세포는 모두 죽고 정상세포는 온전한 상태의 농도로 진행하면 더 좋은 결과를 얻을 수 있는 것 아닌가요? ㅜㅜ 왜 대부분의 논문들이 IC50로 확인되는 농도로 진행 후 확인하는 것일까요? 

아참, 질문이 하나 더 있습니다 선배님. 그리고 약물을 어떤 농도로 처리하고 MTT에서 세포가 모두 죽고 lung cancer에서 발현하는 특정 단백질 역시 western blot에서 확인했을때 검출되지 않는다면 lung cancer 사멸에 효과를 보이는 약물이라고 판단 하는거지요?

감사합니다.
올챙이Jay ewha  |  01.13 18:21  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
1. 우선 in vitro assay에서는 대개의 약물들이 IC50에 해당하는 값으로 (특히 처리 0시간 Untretaed control과 처리 후 24 시간 실험군의 비교값) 처리하게 되면, 48시간 72시간이 지나면서 점진적으로 죽는 모습을 보여서 그래프 등을 더 예쁘게 만들 개연성이 있습니다.

당연히, 고농도로 치게 되면 정상세포도 죽기 때문에, 보통 우리가 발견한 이러한 세포사 기전 또는 약물은 정상세포는 괜찮아~~ 라고 주장하기가 어려워지기 때문에 기를 쓰고 정상세포는 멀쩡, 그리고 암세포는 시간이 들더라도 죽는 농도를 찾는 것입니다..

2. MTT 에서 세포가 모두 죽고, 암세포 특이적 단백질들이 보이지 않는다면, 일단 암세포를 죽이는데는 효과적이겠지요. 그러나 데이터를 발표하기에는 효과적이지 않은 방법입니다.

세포가 죽게 되면 수십분 내에 세포 내의 단백질들이 작살이 나게 됩니다. 따라서, 어떤 경로를 통해 세포사가 일어나게 되는지 알기가 굉장히 힘듭니다.. 다시 1번의 질문의 답과도 연관이 되는데, IC50를 찾아서 실험하는 것이 보통인 이유가, 절반의 세포가 이미 죽어서 내용물을 확인할 수 없더라도 아직은 살아있는 절반의 세포에서 그 과정을 찾을 수 있으리라 기대하기 때문입니다.. 그렇기 때문에 IC50 정 안되면 그 근방값을 잡으려는 거고 완전사멸하는 농도는 알고 있을 필요도 있으며, 논문에 기술도 하지만 (x nM에서 완전히 죽었따, 근데 데이터는 안 보여주지롱~) 그 농도로 실험을 지속하기에는 약물의 가격도 가격이고, 실험하는 사람이 매우매우매우 힘들겁니다.. 남들 35 mm dish 하나 긁어서 샘플링 끝낼 때, 35 mm dish가 아니라 90-100 mm dish를 10장씩 긁어서 간신히 웨스턴 밴드 하나 잡을 수도 있어요.
...  |  01.13 23:42   

선배님, 정성스러운 답변 진심으로 감사드립니다.

우선 IC50값이 나오는 농도로 처리했을 경우 시간에 따른 경향을 얻기가 수월하다라는 이유가있고, 또 세포를 약물 처리 하였을때 IC50값이 의미있는 이유는 절반의 세포는 죽어서 약물이 Activation했다는 것을 확인 할 수 있고 (독성 혹은 약물의 효과) 절반의 살아있는 세포로는 약물에 의한 반응으로 세포의 손상 양상을 (necrosis or apoptosis or cell cycle arrest) Tracking을 할 수 있기 때문이지요?
또한, IC50값을 보이는 약물농도로 처리하는 것이 실험에 투여되는 노력이 (선배님께서 말씀해주신대로 사용되는 약물의 농도 및 처리 시간 등을 고려할 때, 또 많은 과학자들이 IC50값을 보이는 농도로 처리하여 실험 결과를 얻어냈었으니까) 경제적이며 괜찮은 효율을 낼 수 있다는 것이 이유가 되구요. 

선배님 덕분에 생각이 정리가 되어 이 후 실험으로 세포가 완전히 죽는 농도까지 확인은 해보고자하여 IC50 값을 포함할 것이라고 예상되는 넓은 범위의 엑소좀 농도를 여러 셀에서 처리 할 예정이며, IC50값을 갖는 엑소좀 농도를 픽스하고 적용 후 expression marker를 확인해보고자 합니다.

너무 기초적이라서 여쭙기도 민망하고 열심히 검색해보아도 쉽게 답을 구할 수가 없어서 힘들었는데 귀찮아하지 않으시고 차근차근 잘 설명해주셔서 너무 감사드립니다. 오늘 더 많은 것을 알게되어 매우 기쁩니다.

올챙이Jay ewha  |  01.14 00:27  
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