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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 T easy vector를 이용한 dna cloning 질문 있습니다.
알답변 감사합니다(대학생)  |  01.12 12:34

안녕하십니까 선배님들. 왕초보 대학원생입니다.

실험 배경은 이렇습니다.
pGEM 사의 T-easy vector(3kb) , insert DNA(3.2kb, ex-taq enzyme으로 poly A 삽입)
실험 순서는 insert DNA purification 후 product size가 3.2kb인 것을 확인하였고 T-easy vector에 ligation 진행하였습니다. 이후 transformation하여 white colony만 inoculation 진행하였으며 plasmid purification한 다음 sequencing주문하여 확인하였습니다. 
(다른 insert들의 경우엔 프라이머 디자인시 삽입한 restriction enzyme으로 cutting 후 한번 더 밴드 사이즈를 confirm후 진행하지만, 이 insert의 경우엔 vector와 사이즈가 비슷하여 바로 plasmid를 sequencing 주문하였습니다.)
문제는, sequencing 결과를 blast를 통해 확인하였는데, construct의 맨 처음부분 300bp 또는 맨 뒷부분 200bp가 삽입된 것으로 확인되었습니다.
(총 5개의 sample의 sequencing 결과, 2개는 앞부분, 3개는 뒷부분이 들어간 것으로 확인되었으며 모두 같은 부분인 것으로 확인되었습니다.)

비슷한 경험이 있으셨거나 문제점 지도 부탁드립니다.

#cloning
 
#T-easy vector
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[(주)필코리아테크놀로지] NEB사 DNA Seamless Assembly Cloning
NEBuilder HiFi DNA Assembly는 Single tube에서 최대 6개 fragments, 20 kb gene assembly를 15분 내 가능합니다. NEB Golden Gate Assembly는 제한효소 BsaI 및 T4 DNA ligase를 포함한 Assembly Mix, T7 / SP6 promoters 포함한 plasmid 제공합니다.
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

T vector system은 cloning하기에 상당히 편한 system입니다.

결과론적으론 v 3kb에 insert 3.2kb 이더라도 plasmid prep. 후 제한효소 처리 및

fragment를 확인 후 염기 서열 분석을 보내야 합니다.

이렇게 v와 i의 크기가 비슷할 때는 insert를 떼어내는 제한효소로 cutting 및 vector를

1 cut하는 효소로 자르면 insert band를 확인 하기에 충분합니다.

반드시 cloning 후에는 plasmid 분리 및 제한효소 처리를 하여 insert를 확인 후에

염기서열 분석을 의뢰하는게 좋습니다.

대왕개구리SPEED  |  01.12 13:37  
SPEED// 친절한 답변 감사드립니다. 1 cutting으로 confirm 후 삽입된 plasmid로 sequencing 주문 해야겠군요. 
혹시 위 결과와 같이 insert product의 사이즈를 확인하였음에도 불구하고 짧은 절편들만 삽입된 이유를 알 수 있을까요?? 눈에 보이는 밴드 이외의 작은 조각들이 들어갔다고 생각하더라도 5개의 샘플 모두가 같은 절편이 들어갔다는 게 이해가 되지 않습니다. 
알답변 감사합니다  |  01.12 14:10  

insert 크기를 확인 한후 염기서열 분석을 의뢰했는데 결과가 짧게 나왔다면

염기서열 결과가 잘못나왔거나 insert확인이 잘못되었거나 둘중의 하나일겁니다.

앞부분 300bp, 뒷부분 200bp만 나왔다면 3.2kb 중에 중간은 다른 염기서열이 나왔다는

것인지 아니면 염기서열이 읽히지 않았다는 건지 어느 경우입니까?

대왕개구리SPEED  |  01.12 14:45  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
모든 살험은 각 단계마다 확인하는 것은 필수입니다
T vector에 클로닝하면 이론적으로는 x-gal/iptg에서 white 콜로니가 모두 인서트를 가지겠지만 실제는 그렇지 않는경우가 많습니다.
콜로니를 여러개 배양해서 미니프랩하고 반.드.시. 제한효소로 잘라서 인서트의 크기를 확인해야 합니다.
확인없이 클론을 씨컨싱해서 잘못된것을 발견하면 비싼 씨컨싱 비용을 날릴 뿐만 아니라 시간도 날리고 기분도 더러워집니다
모든 실험의 각 단계를 확인하며 진행하는 습관과 각 단계마다 콘트롤을 같이 하는 습관을 가지시길 권합니다.
대왕개구리강시  |  01.12 16:54  
첨부파일 파일첨부: 1.png (10 KB)
이미지 첨부파일

SPEED // 앞부분 300bp만 일치하는 시퀀싱결과가 두가지, 뒷부분 200bp만 일치하는 시퀀싱결과가 세가지 이렇게 각각 총 다섯가지이며, 모두 같은 site입니다. (예를들어, pcr과정에서 사용한 template의 1번부터 300번째 nucleotide만 들어가거나 혹은 뒤에서부터 200개의 nucleotide만 들어간 것으로 읽현다는 뜻입니다.) 
다시 한번 정리하여 말씀드리자면, 두 가지의 케이스로 sequencing의 결과가 나타났는데, 각각의 케이스에서 같은 site가 삽입된 것으로 나타났고, 나머지 부분은 읽히지 않았습니다.(sequencing결과에 t-easy vector가 읽혔습니다. t-easy vector의 T7과 SP6 두 방향으로 읽었으므로 확실합니다.)
도움이 될진 모르겠지만 앞부분만 읽힌 블라스트 결과 첨부하겠습니다. 첨부가 한가지 밖에 안되네요.. (Query가 cloning 하고자 하는 pcr template이며, sbjct가 sequencing 결과입니다.)

알답변 감사합니다  |  01.12 17:46  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

어떤 상황인지 이해가 됐구요..

따라서 모든 cloning 실험에는 colony 확보, colony PCR, plasmid prep., insert RE analysis를

하여 모두 사항에서 target insert가 맞다고 확인 후 염기서열 분석을 의뢰하면

질문과 같은 경우는 발생하지 않습니다.

또한 PCR product를 cloning에 사용 할 경우 깨끗하게 증폭된 경우도 눈에 보이지 않는

비특이 단편의 cloning을 억제하기 위해서 gel elution하여 cloning하는 것도 한번에

cloning을 성공하기 위한 방법 중의 하나입니다.

다시 colony를 분석하여 정확한 insert가 들어간 clone을 염기서열 분석하세요..

그리고 3.2kb는 양방향 염기서열 분석으로 전체 서열을 읽을 수 없기 때문에

처음에는 universal primer으로 읽고 그 다음은 primer walking 방법으로 중간을

읽어야 전체 3.2kb의 완전한 서열을 읽을 수 있습니다.

대왕개구리SPEED  |  01.12 18:16  
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