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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western blot 시 디벨롭이 반만 되는 문제
알easy9095(대학원생)  |  01.10 16:23
첨부파일 파일첨부: 제목 없음.png (67 KB)
이미지 첨부파일

사진 첨부한 것 참고 부탁드립니다.

트렌스퍼 후 폰슈 확인했을 때도 사이즈별로 다 밴드들이 골고루 뜨는 것을 확인했습니다.
그런데 디벨롭만 하고 왔다 하면
저렇게 어느 사이즈 이하부터는 꼭 멤브레인을 반으로 자른 것처럼
아랫부분이 나오질 않습니다.

멤브레인을 아랫부분만 잘라서 아주 강하게 익스포져 하면
밴드들이 조금 나오긴 하는데...

저렇게 딱 반으로 가르듯 윗사이즈 부분만 디벨롭이 진하게 되는 이유가 뭔가요?
gel은 8% 썼구요
사진 상에서 빨간 점이 찍힌 레인은 사실 아무것도 없는 1X Sample buffer를 걸어준거라
사실 아무것도 안 나와야 정상인데요
저 레인에도 같은 사이즈까지 진하게 나오고 밑은 아무것도 없어서
이게 대체 무슨 문제인지 모르겠습니다..
폰슈 확인했을 때는 sample buffer 건 부분은 깨끗하고
샘플 건 레인만 딱 이쁘게 염색이 되었는데 말이죠..ㅠㅠ

대체 왜 이러는 걸까요?ㅠㅠ
참고로 안티바디는 streptavidin 입니다.

#웨스턴블롯
 
#western blot
 
#develop
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

중간에 있는 찐한 밴드가 타겟밴드인가요?

well에 내 target 항원이 너무 많은경우 내 밴드 위쪽으로 다 반응하는 모양으로 발색되는 경우가 있습니다.

샘플 로딩양을 꽤 많이 줄여 보세요

금개구리안재진  |  01.11 14:27  

1. 샘플버퍼만 넣었는데 밴드가 보인다.
 해결법
 ① 샘플버퍼를 새로 장만한다. 가능하면 구입해서 써본다.
 ② 로딩과정에서 넘쳐서 또는 파이페팅 기술의 미숙함.
 ③ 젤 또는 버퍼의 오염.

2. 윗쪽만 보이는 이유.
-> 상대적으로 윗쪽에 많이 붙어서.
-> 타겟 밴드가 위에 있는가? -> 그렇다면 아무 문제 없음.
-> 타겟 밴드가 아래에 있는가? -> 윗쪽 멤브레인을 자르고 블록킹부터 시작하기.
-> 타겟 밴드가 위, 아래에 있는가? 그리고 동시에 봐야만 하는가? -> 1차, 2차 안티바디를 충분하게 넣어줘야 함. 그래도 안되면 안티바디의 질이 안좋거나 샘플이 안좋거나 둘 중 하나일 가능성 높음. -> 발색 시 윗쪽만 찍고 진한 밴드부분의 아래쪽을 잘라 아랫부분만 다시 찍어서 본다.

3. 멤브레인이 더럽게 나온다.
 해결법
  ① 모든 과정에서 오염 가능성을 완전히 배제한다. (기술의 문제)
  ② 와시 과정을 잘 해준다. 그래도 안되면 트윈20을 0.3%로 늘린다. 이때 너무 오래하면 안
      좋다.
  ③ SB를 넣고 끓이는 것을 잘해야 한다. 머캅토 에탄올이 있는지 꼭 확인한다.

결론 : 자세한 실험 과정을 생략하였으므로 원인은 알 수 없다. 샘플링부터 익스포져 까지 모든 과정을 세세하게 (심지어 장갑은 어떤것을 어떻게 썻는지 까지) 작성해야 비교적 정확한 트러블 슈팅이 가능함.

개구리절대교주  |  01.11 14:38  
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