[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
웨비나 모집
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2
전체보기 안전점검 논문교환
 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
조회 2984  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 cloning 진행 후 받은 cell stock에서 insert 확인이 안됩니다.
올챙이alalalalalalal(대학원생)  |  01.10 11:42
첨부파일 파일첨부: cx3cr1,IFNg E-o.jpg (156 KB)
이미지 첨부파일

target gene 과 vector를 cloning 주문하여 cell stock과 plasmid dna 형태로 받았고,
cloning 진행 방식은 target gene 앞뒤에 서열을 추가하여 ecor1 one cut으로 진행했다고 알고있습니다.
받은 dna로 ecor1 digestion 하였을때 원하는 insert(500bp)도 확인하였습니다.
받은 샘플을 mini-prep 진행하기 위해 cell stock을 키우려고 하는데 컴셀을 stbl3 사용하였다고 하여, -70도씨에 보관하던 cell stock을 살짝 찍어 LB plate(amp+100ug, Miller) 30도씨에 16시간과 24시간 배양해보았고, 콜로니를 따서 LB lipuid 배지에 배양하여 미니 프렙 진행하여 dna를 뽑았습니다. plasmid dna 받았을때와 동일한 시간으로(ecor1 37도씨 1시간) 엔자임 컷을 진행한 결과, 원하는 insert가 나오지 않는데 어느 과정에서 문제가 있는걸까요..?
30도씨가 아닌 37도씨에서 배양하였을때도 같은 결과가 나왔습니다.
cell stock이 아닌 받은 plasmid dna 를 transformation 하여 진행해도 엔자임 컷 진행하면 원하는 insert가 나오지 않습니다..

#클로닝
답변하기
검색광고 검색광고
[(주)필코리아테크놀로지] NEB사 DNA Seamless Assembly Cloning
NEBuilder HiFi DNA Assembly는 Single tube에서 최대 6개 fragments, 20 kb gene assembly를 15분 내 가능합니다. NEB Golden Gate Assembly는 제한효소 BsaI 및 T4 DNA ligase를 포함한 Assembly Mix, T7 / SP6 promoters 포함한 plasmid 제공합니다.
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

첨부 사진 설명이 없네요.

그리고 plasmid를 EcoRI외에 다른 엔자임으로도 잘라봤나요?

받은 dna로 ecor1 digestion 하였을때 원하는 insert(500bp)도 확인하였습니다.

: 이때 받은 plasmid가 남아있다면 DH5a나 다른 cloning host에 한번 TF해서

확인해 보는 것도 좋을 듯합니다.

대왕개구리SPEED  |  01.10 12:34  

지금 질문하신 내용으로는

1.  DNA cutting이 안되서 insert가 안보인다.
2. plasmid 가 뒤바껴서 insrt가 안보인다.

이정도가 될것 같네요...

EcoRI이 문제 없다는 실험을 진행하시면 plasmid DNA가 문제가 되겠네요..

다시 transformation을 진행하시것이 방법이 될수 있습니다.

금개구리안재진  |  01.10 13:38  

첨부한 사진은 cell stock을 30도씨에 배양후, mini-prep 하여 엔자임 컷 한 결과입니다.
500bp에 insert가 보여야 하는데 3kb 이상의 밴드가 여러개 뜬것을 확인하였습니다.

받은 plasmid DNA로 DH5a 사용하여 TF 진행하여 엔자임 컷 하였는데도 첨부한 사진과 같은 결과가 나옵니다..

TF 과정
-DH5a 아이스에 녹임
-dna 1ul+com cell 25-30ul
-20min incubation in ice
-heat block 42도씨 45sec
-2min incubation in ice
-LB lipuid(amp X) 300ul+cell 37도씨 shaker incubation  200rpm 45min
-LB plae(amp O) 도말 후 spreading
-37도씨 o/n
으로 진행하였습니다. 미니프렙하였을때 농도는 500ng/ul 근처로 나오는데 처음 받은 plasmid dna와 동일한 조건으로 엔자임컷하여 확인하면 왜 저런 밴드가 뜨는지 모르겠습니다..

올챙이alalalalalalal  |  01.10 18:50  
답변하기
할인행사 광고 검색광고
정코퍼레이션 정코퍼레이션
LN2용 Cryo Label 할인 및 셋팅시 1,000매 서비스 추가 지급 행사 (4.31까지)
엘알에스랩 엘알에스랩
Cloud-Clone 한국대리점 10주년행사 ***** Antibodies 55% Off (5.31까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
Eppendorf 2019 상반기 Promotion Special Offer : 특별한 기회를 놓치지 마세요! (6.30까지)
프리미엄 등록안내
최근등록   더보기 >
이 중에서 Agar랑 같이 넣으면 문제생기는 성분이 뭘까요?   03.22
계통수 해석   03.22
MEF와 M ESC차이가 뭔가요?   03.22
일반화학실험 레포트 도와주세요ㅠㅠ   03.22
PCR밴드가 끌립니다.   03.22
LB배지 위에 나타난 균은 무엇인가요?   03.22
웨스턴블랏 protein sample만드는도중 boiling을 방치한채 까먹었습니다   03.22
고등학교 생화학실험 질문   03.22
PCA 배지가 굳지를 않습니다   03.22
in vivo에 endogenous cell migration 확인 방법   03.22
영국문화원
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북    RSS서비스 RSS
다윈바이오