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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 cloning 진행 후 받은 cell stock에서 insert 확인이 안됩니다.
올챙이alalalalalalal(대학원생)  |  01.10 11:42
첨부파일 파일첨부: cx3cr1,IFNg E-o.jpg (156 KB)
이미지 첨부파일

target gene 과 vector를 cloning 주문하여 cell stock과 plasmid dna 형태로 받았고,
cloning 진행 방식은 target gene 앞뒤에 서열을 추가하여 ecor1 one cut으로 진행했다고 알고있습니다.
받은 dna로 ecor1 digestion 하였을때 원하는 insert(500bp)도 확인하였습니다.
받은 샘플을 mini-prep 진행하기 위해 cell stock을 키우려고 하는데 컴셀을 stbl3 사용하였다고 하여, -70도씨에 보관하던 cell stock을 살짝 찍어 LB plate(amp+100ug, Miller) 30도씨에 16시간과 24시간 배양해보았고, 콜로니를 따서 LB lipuid 배지에 배양하여 미니 프렙 진행하여 dna를 뽑았습니다. plasmid dna 받았을때와 동일한 시간으로(ecor1 37도씨 1시간) 엔자임 컷을 진행한 결과, 원하는 insert가 나오지 않는데 어느 과정에서 문제가 있는걸까요..?
30도씨가 아닌 37도씨에서 배양하였을때도 같은 결과가 나왔습니다.
cell stock이 아닌 받은 plasmid dna 를 transformation 하여 진행해도 엔자임 컷 진행하면 원하는 insert가 나오지 않습니다..

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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

첨부 사진 설명이 없네요.

그리고 plasmid를 EcoRI외에 다른 엔자임으로도 잘라봤나요?

받은 dna로 ecor1 digestion 하였을때 원하는 insert(500bp)도 확인하였습니다.

: 이때 받은 plasmid가 남아있다면 DH5a나 다른 cloning host에 한번 TF해서

확인해 보는 것도 좋을 듯합니다.

대왕개구리SPEED  |  01.10 12:34  

지금 질문하신 내용으로는

1.  DNA cutting이 안되서 insert가 안보인다.
2. plasmid 가 뒤바껴서 insrt가 안보인다.

이정도가 될것 같네요...

EcoRI이 문제 없다는 실험을 진행하시면 plasmid DNA가 문제가 되겠네요..

다시 transformation을 진행하시것이 방법이 될수 있습니다.

금개구리안재진  |  01.10 13:38  

첨부한 사진은 cell stock을 30도씨에 배양후, mini-prep 하여 엔자임 컷 한 결과입니다.
500bp에 insert가 보여야 하는데 3kb 이상의 밴드가 여러개 뜬것을 확인하였습니다.

받은 plasmid DNA로 DH5a 사용하여 TF 진행하여 엔자임 컷 하였는데도 첨부한 사진과 같은 결과가 나옵니다..

TF 과정
-DH5a 아이스에 녹임
-dna 1ul+com cell 25-30ul
-20min incubation in ice
-heat block 42도씨 45sec
-2min incubation in ice
-LB lipuid(amp X) 300ul+cell 37도씨 shaker incubation  200rpm 45min
-LB plae(amp O) 도말 후 spreading
-37도씨 o/n
으로 진행하였습니다. 미니프렙하였을때 농도는 500ng/ul 근처로 나오는데 처음 받은 plasmid dna와 동일한 조건으로 엔자임컷하여 확인하면 왜 저런 밴드가 뜨는지 모르겠습니다..

올챙이alalalalalalal  |  01.10 18:50  
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