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질문 cell counting 할때 cell이 안보여요ㅠㅠ
알ea(과기인)  |  01.09 18:03
학부생인데 연구실을 처음 들어왔습니다
cell counting을 하는데
1×10^5, 3×10^4으로 배양하는데
1×10^5은 60%정도 차있었고, 3×10^4은 절반도 안차있었어요
cell counting을 하는데 먼저 3×10^4배지를 counting하려니까 cell이 안보이더라구요ㅠㅠㅠ그래서 선배가 다시 해줬는데 그때 18개정도 cell이 있었어요
그다음 1×10^5배지를 제가 해서 보니까 또 cell이 하나도 안보이더라구요..
tryphan blue랑 섞기전에 pipetting도 충분히 해주고
20ul씩 혼합해서 hemocytometer로 관찰했어요
대체 어디서 잘못된건지 모르겠어요ㅠㅠㅠㅠ
이틀연속 cell counting실패중이라 너무 우울해요..
실패요인이 뭘까요ㅠㅠㅠ
#cell counting
 
#hemocytometer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

셀 숫자에 대해 파악하려면 우선 well 수 혹은 dish 크기를 알려주셔야 할 것 같습니다.
그리고 cell line마다 크기가 다 달라서 숫자도 다릅니다. stock을 구매한 회사 홈페이지에 들어가 보면 plate별로 꽉 찼을 때 number가 나오기도 하니 참고해보세요.


그리고 1*10^5으로 배양했다는 것이 무슨 의미인지 모르겠습니다.
1*10^5개의 cell을 깔고 싶다는 것인가요?
아니면 1*10^5를 깔아서 며칠이 지난 cell을 계대배양하고자 하는 것인가요?


제 생각에 가능성은
1. cell이 너무 적거나
2. pipetting 후 세포를 소량 따는 것이 늦어서 가라앉아 버렸다거나
3. trypsin-EDTA의 처리 후 세포가 제대로 떨어지지 않아서이거나
정도입니다.


그리고 hemocytometer에 18개 들어왔다 하더라도 적은 숫자일 것 같은데 셀을 좀 더 키워서 계대배양하던지 셀을 깔던지 하는 게 좋을 것 같습니다.

뒷다리뷰냐  |  01.09 22:03  

18개 정도면 세포 현탁액 1mL당 9*10^4개 있었다는 이야기인데 너무 적습니다. (몇 미리로 희석했는지는 모르겠지만요)


제가 키우는 cell 기준으로,
100파이 기준으로 60% 찼다면 적어도 1.5*10^6개는 있어야 할 듯한데요.


어디선가 loss가 일어나지 않았을까 싶습니다.


원심분리 후 suction 과정 혹은 trypsin-EDTA 처리 과정을 살펴보세요.

뒷다리뷰냐  |  01.09 22:11  
크기는 60파이구요 처음에 1*10^5개를 깔았습니다!
pipetting한 직후에 세포를 땄고 trypsin-EDTA처리후 cell이 떨어진것도 확인을 했어요ㅠㅠ
cell이 적긴하지만 선배가하면 cell이보이는데 제가하면 cell이 안보이고..ㅠㅠㅠㅠcell이 더 많이 차있는 플레이트에서도 cell이 안보이더라구요
1. 배지석션
2. PBS 4ml넣고 석션
3. trypsin-EDTA 2ml넣고 천천히 흔든 후 석션
4. 2분 incubation(cell떨어진거 확인)
5. FBS 4ml resuspend
6.tryphan blue 20ul, cell 20ul 혼합
(cell따기전에 pipetting)
7.hemocytometer에 20ul넣음
이렇게 진행했습니다ㅠㅠㅠ
알ea  |  01.10 00:44  
60pi plate에 트립신 처리하고
배지 또는 fbs로 희석을 한 후
15mL tube에 옮겨 원심분리를 합니다
트립신을 석션하면 밑에 pellet만 남지요
그 후 배지로 resuspend하고 세포 수를 셉니다.

이 과정대로 진행한 것 맞으시죠?

아니면 펠렛의 양을 보고서도 셀 수를 대략 파악할 수 있습니다. 60파이에 60퍼면 펠렛이 보이긴 보일겁니다. 석션할 때는 펠렛을 피해서 하면 되구요. 원심분리가 지나치게 약하거나 짧으면 셀이 충분히 가라앉지 않을 수도 있습니다. Resuspend할 때 펠렛이 사라지는 것을 보며 잘 섞인 것을 확인합니다. 펠렛이 적당량 맺힌 것 확인하실 수 있었나요?

그리고 같은 샘플에서 선배는 되는데 님은 안 되셨다면 결국 손 스킬의 문제일 듯한데요.
정 안 나온다면 세포 현탁액에서 20uL를 딸 때 팁을 조금 깊숙히 넣어서 취해보세요
뒷다리뷰냐  |  01.10 03:08  
저희 실험실에서는 원심분리기를 사용하지않고 cell counting을 하더라구요! 답변해주셔서 감사합니다ㅠㅠㅠ
알ea  |  01.10 08:35  
궁금해서 그러는데 원심분리를 하지 않으면 trypsin-EDTA를 어떻게 제거하나요?
뒷다리뷰냐  |  01.11 14:36  
석션해서 제거했어요!
알ea  |  01.12 15:11  
원심분리하지 않고 석션하면 cell들이 모두 빨려들어가버리지 않나요?
뒷다리뷰냐  |  01.13 14:15  
incubation하기 전에는 cell이 아직 플레이트에 부착되어있어서 괜찮아요!
알ea  |  01.23 19:57  
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