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질문 ELISA를 위한 단백질 정량을 어떻게 하나요?
알파푸누리(대학원생)  |  2018.12.03 22:24
정제한 단백질을 이용해 ELISA를 진행하려 합니다. 그런데 coomassie staining했을때 정제한 단백질의 purity가 좋지는 않습니다.

이럴경우 coomassie staining해서 BSA의 band 크기와 비교해, 대략적인 단백질 농도를 바탕으로 coating할 양을 정해야하는건가요? 아니면 ELISA나 BCA같은 정량법을 이용해 정량된 값을 구해 진행해야 하나요?

어떤 방법이 가장 logic한 방법일까요?  아니면 위에 언급하지 않은 다를 방법이 있을까요? 알려주시면 감사드리겠습니다. 부탁드려요!
#ELISA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

purity가 낮은 단백질의 정량은 BCA와 같은 total 단백질 정량방법은 오차가 큽니다.

먼저 BSA를 순도를 기준으로 SDS-PAGE에 loading양 별로 몇개 lane을 전기영동하여

density값을 구합니다.

예를들어 98% BSA를 0.5ug, 1ug, 1.5ug, 3ug을 각각 loading한다음 image doc 장비로

density를 읽어서 수식을 만들어 놓고 target protein을 loading 양을 달리하여

몇개 lane를 loading하여 BSA와 비교하여 어느정도의 단백질 양을 추정할 수 있습니다.

단 이때 BSA와 sample은 같은 gel에서 실험하는 것이 그나마 오차를 줄일 수가 있습니다.


대왕개구리SPEED  |  2018.12.03   
그럼 말씀하신 방법으로 추정한 단백질의 농도를 가지고 수치화하는 방법 뿐인건가요?

사실 coomassie staining도 amino acid서열에 따라 staining되는 정도가 다르다고 알고 있어서 

"coomassie staining해서 나온 band의 density로 단백질 양을 '추정'해서 실험 한다는게 logic한가?:

라는 의문이 해결되지 않아 다른 방법이 있을까 해서 질문을 하게된거라서요.

알파푸누리  |  2018.12.03   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. 그럼 말씀하신 방법으로 추정한 단백질의 농도를 가지고 수치화하는 방법 뿐인건가요?

: 네.. 100% 정제된 단백질이 없는 한 정확히 특정단백질을 정량한다는 것은 불가능

합니다.

2. 사실 coomassie staining도 amino acid서열에 따라 staining되는 정도가 다르다고 알고

있어서 

: 네.. 맞습니다.


3. "coomassie staining해서 나온 band의 density로 단백질 양을 '추정'해서 실험 한다는게

logic한가?:

: 다시 설명하지만 100% 정제된 단백질을 가지고 실험하는것 외에 가장 정확한 방법이

앞에서 설명한 방법입니다.

목적 단백질의 항체가 있더라도 100% 정제된 단백질을 가지고 검량선을 그리지 않으면

정량할 수 없습니다.

경럼으로 봤을 때 SDS-PAGE에서 정량하는방법은 실제 100% 정제된 단백질과 정량

비교해서 +/- 20% 정도는 편차가 날겁니다.

다른 방법이 있으면 저도 사용해 보고 싶네요.

대왕개구리SPEED  |  2018.12.04   
의문점이 풀린것 같습니다. 너무 감사드립니다!
알파푸누리  |  2018.12.04   
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