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 전체 > Microbiology > Virus
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질문 클로닝이 네달째 안되고 있어요 도와주세요ㅠㅠ
알생화학방(대학원생)  |  09.14 20:10
 현재 클로닝이 계속 안되고 있습니다.
vector: pCVD442, insert: pcr product(purification 완료)

upload imageupload imageupload image
순서대로 vector1,vector2,insert, gel extraction한 결과의 vector1,vector2,insert 입니다.
그리고 혹시나 라이게이션의 문제인가 싶어서 확인해보니

upload imageupload image
다음과 같이 라이게이션이 이루어졌는데 다른분께서는 같은 라이게이즈를 했는데도 실험을 성공하신것 보면 그건 아닌것 같고 저는 계속 클로닝된 plate, self 둘다 다 뜨지만 막상 pcr해보면 공백터 사이즈만 나옵니다. 혹시나 제 실험의 문제가 있다면 지적해주세요.


<실험방법>
enzyme cut: total-30, dna-25, xba1-1,sac1-1, buffer-3
37도 2시간 

ligation: total-15, vector-3, insert-9, buffer-1.5, ligase-1.5
16도씨 오버나이트

#cloning
#클로닝
#ligation
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
Enzyme cut 사진은 없네요

colony는 일단 형성은 되는거 같구요~

확인은 어떻게 하신거죠? 콜로니따서 키운다음에 prep 후 Enzyme cut 하셨는데 insert가 없는건가요?
파브레  |  09.14 20:23   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
 double digestion이 안되서 그런거 같은데, 확실히 자르고(같이 있을때 둘다 active할수 있는 buffer를 쓰거나, 없으면, 각각 따로 자르세요),
vecter의 경우 alkaline phosphatase (CIP) 처리해서 self 되도록 안나오게 하세요.
알Jacques L. Monod  |  09.14 20:50  
파브레님 저기 맨위에 사진이 enzyme cut 사진이구요 

하기전의 사진입니다.
 upload image

1번과 2번은 pCVD442입니다.

upload image
1,2,3,4번은 Insert 입니다.


확인은 amp plate에 transformation한 것을 깔아서 다음날 콜로니를 따서 콜로니 pcr로 진행을 하면 공백터만 나옵니다.
그래서 insert가 안들어간것 같은데 어떻게 해야할지...



알생화학방  |  09.15 10:32  
Jacques L. Monod님, 
현재 enzyme은 NEB회사것을 쓰고 있습니다.
버퍼4번이 둘다 호환이 100%가 되어서 하고있습니다.
만약 따로따로 자를경우에는 Sac1이나 Xba1으로 자른후에 gel extraction까지 거기서 나온 생성물로
다시 다른 엔자임으로 잘라서 gel extraction을 진행하면 될까요?
그리고 만약에 cip처리시 total 30마이크로 로 enzyme cut을 37도,1시간 하고 거기에 cip1마이크로 정도를추가해서 넣고
다시 enzyme cut을 1시간 진행하면 되는건가요


알생화학방  |  09.15 10:38  
 ㅋㅋ 좋습니다~

그러면 Enzyme cut 후에 각각 vec 랑 insert를 extraction해서 정제해서 ligation 하신거잖아요~

그리고나서 transformation 하신후에 형성된 colony로 colony pcr을 하신거구요~

colony pcr은 많이 해보시다보면 느끼실텐데 정확하지 않습니다~

차라리 transformation 후에 형성된 colony를 5~6개 정도만 배양해서

plasmid prerp 후에 나온 dna를 가지고 pcr 해보시는게 좋을 거 같습니다~  plasmid를 시퀀스 하셔도 되구요~

실험목적이 뭔지 제가 아직 몰라서요~

고생하세요~

파브레  |  09.15 20:49   
 insert 사이즈가 얼마인가요?  사이즈가 커서 잘 안들어가는거 같네요.

topo xl 같은 클로닝 키트 활용해보심 어떨까싶네요.





앞다리OLOHO  |  09.19 23:18  
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