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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문 beta-actin이 2밴드가 떠요 ㅠㅠ
올챙이메밀(대학원생)  |  09.14 11:41
첨부파일 파일첨부: 11.png (175 KB)
이미지 첨부파일

cell을 trypsin으로 때서 모은 후,  NP-40 buffer (+PI)로 lysis를 하고 bradford를 정량하는데

gel을 150볼트로 내린 후, 5% Skim milk로 상온에서 1시간 블라킹하고
1:5000으로 1차 액틴 4도씨에서 O/N
1:5000 2차 rabbit으로 RT에서 1시간
으로 분석을 했는데

계속해서 뒤에 흐릿한 밴드가 뜨거나 밑에 밴드가 뜹니다 ㅠㅠ

혹시나 lysis 단계에서 cleaved 된건지 gel을 너무 빨리내려서 그런지 안티바디문제인지
정확하게 어떤 문제인지 몰라 글을 올립니다.

저번 한번은 10번 쯤 쓴 안티바디로 혹시나 안티바디 문제일까 하여 stripping을 해서 새로운 안티바디로 붙히면 다시 이쁘게 뜨는 경우도 있었지만

이번에는 3번 밖에 쓰지 않은 fresh한 상태라 왜 저런 밴드들이 뜨는지 모르겠습니다.

액티 말고 다른  target 단백질들은 one 밴드로 이쁘게 뜨는데 액틴이 저런 경우는 왜그럴까요?

#western
#multi band
#actin
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
 안티바디를 붙힐 때 다른 안티바티를 붙혔다 뗀 멤브레인에 다시 붙히게 되면 발생합니다.
깨끗한 멤브레인에 안티바디를 붙히면 횟수가 여러 번 됐다고 저런 문제가 생기는 것이 아닌 걸로 알고 있습니다(간혹 안티바디가 오래 되서 분획으로 잡히는 경우가 있기는 합니다)
청개구리pegasus  |  09.14 11:59  

stripping 하지 않은 membrane에서 잡힙니다

원인이 뭘까요,..

올챙이메밀  |  09.14 13:57  
스태킹 젤에서 60V로 완전히 다 내려와서 세퍼레이팅 젤에서 조금 분리가 된다 싶을 때 100V로 적당히 내려올 때 까지 젤러닝 하세요.

그게 한 40 kDa이니까... 10% 젤로 러닝하면 잘 나올 것 같네요.

트랜스퍼 환경은 말 안해서 모르겠습니다.
청개구리절대교주  |  09.14 14:06  
 혹시 Abcam 사 안티바디 인가요??
저도 그런 현상이 있었는데
Blocking 을 Milk 에서 5% BSA 로 했더니 더블밴드가 사라지더군요

혹시 A 사 안티바디라면 Milk blocking 했을 때 더블밴드 나오는게 정상입니다.

http://www.abcam.com/beta-actin-antibody-mabcam-8226-loading-control-ab8226.html
위 링크의 데이터 시트 5페이지 참고하세요.
청개구리Marine  |  09.14 16:09  

우선, 다른 세포나 세포주에서는 어떠한지 먼저 확인하시는 걸 추천합니다.

stripping이나 reprobing을 하고 나면 원래 희미한 잡밴드는 날라갑니다.

PVDF에 더 이상 붙어있지 않기 때문에요. 물론 그걸 데이터로 삼으면 큰

문제가 생깁니다만..

...  |  09.14 23:15   
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